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[求救] competent cell製作

看板Biotech (生命科學)作者 (bolly)時間17年前 (2008/09/30 13:35), 編輯推噓7(7推 0噓 12→)
留言19則, 11人參與, 7年前最新討論串1/4 (看更多)
我們實驗室之前都是直接買kit作transform 但是我覺得有點浪費 所以想試著自己作作看 我用一瓶看起來有點年代的氯化鈣配製成0.1M溶液(已滅菌) 將0.5ml over-night菌液加入50ml LB養到OD 0.4 3200g離心去除上清液 加入20ml氯化鈣使懸浮 置冰上40min 離心10min 去除上清液 最後加1ml氯化鈣重新懸浮 分裝0.2ml一管 製作的菌種是DH5aphla 和BL21(DE3) 直接作transform 但是都長不出來 我想請問製作過程還需要注意什麼小細節 因為我是自己摸索 已經作過好幾次都不成功 之前有請別間實驗室的學姐教過 有作出來 但是使用的藥品是他們實驗室配的 回來自己作的幾次都失敗 很灰心= = -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.202.50
推
09/30 13:40, , 1F
3200g，感覺有點快，我們都只是1000g而已，參考看看吧
09/30 13:40, 1F
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09/30 14:11, , 2F
1000g是離心多久呢
09/30 14:11, 2F
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09/30 14:50, , 3F
做這個超搞剛~連細菌生長狀況都要監控~用買的拉
09/30 14:50, 3F
推
09/30 15:10, , 4F
貼上 #14wnDD_4 參考本版我po的那篇, 之前我常作!!
09/30 15:10, 4F
推
09/30 15:12, , 5F
OD0.6已經快要過log期了吧- -
09/30 15:12, 5F
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09/30 15:12, , 6F
我們是0.375 通常0.32-0.35就會拿起來用了
09/30 15:12, 6F
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09/30 15:13, , 7F
還有CaCl2也要加一些東西
09/30 15:13, 7F
推
09/30 16:36, , 8F
做完放在四度冰箱 12-24小時使用 可增加效率
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09/30 16:38, , 9F
上面我有打錯 應該是OD 0.4 抱歉
09/30 16:38, 9F
※ 編輯: bolly 來自: 140.120.202.50 (09/30 16:39)
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09/30 16:40, , 10F
所謂的氯化鈣要再加一些東西是哪些東西?
09/30 16:40, 10F
推
09/30 17:23, , 11F
CaCl2我會wash兩次，最後一次resuspend會多加glycerol抗凍
09/30 17:23, 11F
推
09/30 18:00, , 12F
小弟若沒全程在cold room做，也會全程在冰上
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09/30 18:04, , 13F
不用pipette up and down來resuspend,要溫柔...
09/30 18:04, 13F
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09/30 18:05, , 14F
CaCl2重配一罐,再試一次吧!
09/30 18:05, 14F
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2500xg, 2400xg
09/30 20:29, 15F
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10/01 00:56, , 16F
氯化鈣我再向別間借一些來試試看吧
10/01 00:56, 16F
推
10/01 00:57, , 17F
原po可以去參考Q牌QIAexpressionist系列裡面的作法 效果好
10/01 00:57, 17F
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11/11 01:01, , 18F
氯化鈣我再向別間借一些 https://muxiv.com
11/11 01:01, 18F
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01/03 16:45, 7年前 , 19F
做這個超搞剛~連細菌生 https://daxiv.com
01/03 16:45, 19F
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