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[求救] promoter cloning

看板Biotech (生命科學)作者 (歐巴馬)時間12年前 (2013/04/09 14:13), 編輯推噓9(9推 0噓 18→)
留言27則, 10人參與, 最新討論串2/3 (看更多)
這實驗目前已經卡了一陣子 希望版友能幫忙看看有甚麼問題 目前我的實驗是想看TIMP3 promoter 的轉錄活性 所以選定了一段-934~+278的位置 想接到pGL3-Basic vecter 上 利用軟體分析之後設計不含此序列切位的primer 5'端加上XhoI切位 primer 3'端加上HindIII切位 使用Pfx PCR 之後 跑膠確定為single band 接著取1ug的PCR產物 與1ug的vector 同時切XhoI及HindIII 後OVER NIGHT 隔天跑膠後將之切膠純化(也有使用直接純化的方法) 以vecter:insert 1:3 1:10等比例　ligation 16度　overnight後 隔天進行transformation，也順便塗一盤單純用BASIC的 結果只有BASIC有長，而切膠純化後的都沒有長 直接純化不切膠的有長很多，但PCR確認過都是空載體（可能酵素作用不完全BASIC長的） 不知道板上有沒有好心人能幫忙看看到底那邊出了問題 感激不盡！～～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.138.38
推
04/09 14:40, , 1F
Primer末端的cutting site有沒有多留幾個mer?
04/09 14:40, 1F
→
04/09 17:20, , 2F
想問看看cutting site加幾個mer的意義是？?
04/09 17:20, 2F
推
04/09 17:24, , 3F
要多留一些mer讓酵素有地方可以站上去在specific site作用
04/09 17:24, 3F
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04/09 17:26, , 4F
那加的mer有限定要ATGC哪種嗎　還是都可以
04/09 17:26, 4F
推
04/09 17:32, , 5F
看酵素datasheet裡面都有寫，要留幾個以上跟偏好的基都有
04/09 17:32, 5F
推
04/09 21:57, , 6F
看你的描述我可以想到好多可能的問題... 我覺得最快的方法是
04/09 21:57, 6F
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04/09 21:58, , 7F
找一個你附近作cloning很順的人 跟他一步步確認你的做法
04/09 21:58, 7F
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04/09 21:58, , 8F
最好是可以請他幫你做 全照他的方式來做 然後你在旁邊看跟學
04/09 21:58, 8F
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04/10 00:21, , 9F
PCR產物有1ug以上,好奇你如何定量的,如果真用這麼多還做不
04/10 00:21, 9F
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04/10 00:22, , 10F
出來,實在需要找個會做的人在旁指導了,不少描述都有問題
04/10 00:22, 10F
推
04/10 02:46, , 11F
甚麼是直接純化....
04/10 02:46, 11F
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04/10 02:47, , 12F
問一下 你選的位置應該沒有轉譯起始點吧?
04/10 02:47, 12F
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04/10 07:16, , 13F
04/10 07:16, 13F
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04/10 07:18, , 14F
好巧不巧 這兩個酵素沒多留幾個mer切再久效率都很差
04/10 07:18, 14F
推
04/10 07:21, , 15F
看推文你似乎沒多放,所以先從這著手吧
04/10 07:21, 15F
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04/10 10:45, , 16F
這部分我們實驗室也算剛入門能問的人不多 很感謝大家的回答
04/10 10:45, 16F
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04/10 10:45, , 17F
我在研究看看
04/10 10:45, 17F
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04/10 10:56, , 18F
回j大 這段序列沒包含到轉譯起始點
04/10 10:56, 18F
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04/10 11:01, , 19F
不知道是不是需要包含到?
04/10 11:01, 19F
推
04/10 11:56, , 20F
做TA也是可以。
04/10 11:56, 20F
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04/10 13:01, , 21F
用pfx去PCR 好像不能用TA作的樣子
04/10 13:01, 21F
推
04/10 13:38, , 22F
加個a而已........= =做個tailing
04/10 13:38, 22F
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04/10 16:23, , 23F
瞭解了 感謝指導!!
04/10 16:23, 23F
推
04/12 01:18, , 24F
我覺得問題應該就是mesenchymal大大說的..Y
04/12 01:18, 24F
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04/12 01:19, , 25F
所以inser其實沒有被切 也就接不上囉
04/12 01:19, 25F
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04/12 01:20, , 26F
ligation product可以拿去跑PCR先check 很快就知道結果了
04/12 01:20, 26F
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04/12 01:28, , 27F
cloning還是一步一步check比較能找出問題.
04/12 01:28, 27F
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jeffsu
12年前, 04/09
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