Re: [求救] promoter cloning

看板Biotech (生命科學)作者licat (licat)時間12年前 (2013/04/11 22:33)推噓3(3推 0噓 5→)

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因為看到你說附近沒人可以幫, 所以我指出一些可能的問題點... 但不確定真是你卡關的因素, 當然更希望你的問題已解決, 後面就不用看了 ※ 引述《jeffsu (歐巴馬)》之銘言： : 這實驗目前已經卡了一陣子希望版友能幫忙看看有甚麼問題 : 目前我的實驗是想看TIMP3 promoter 的轉錄活性 : 所以選定了一段-934~+278的位置想接到pGL3-Basic vecter 上 : 利用軟體分析之後設計不含此序列切位的primer : 5'端加上XhoI切位 primer 3'端加上HindIII切位 : 使用Pfx PCR 之後跑膠確定為single band : 接著取1ug的PCR產物與1ug的vector 同時切XhoI及HindIII 後OVER NIGHT ^^^^ ^^^^^^^ 你是用哪一牌的酵素? 用的buffer對兩種酵素的相容性都是100%嗎? 不需要切overnight, 反而會有亂切的風險作用2-4 hr已非常足夠 : 隔天跑膠後將之切膠純化(也有使用直接純化的方法) : 以vecter:insert 1:3 1:10等比例　ligation 16度　overnight後 : 隔天進行transformation，也順便塗一盤單純用BASIC的 : 結果只有BASIC有長，而切膠純化後的都沒有長 : 直接純化不切膠的有長很多，但PCR確認過都是空載體（可能酵素作用不完全BASIC長的） ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 這部分代表 1. 有載體可能一刀都沒被切 2. 有載體只被切了一刀, 然後ligation時重新黏回所以才會長出帶有空載體的菌落 (如果照預期被切兩刀, 應該就都不會長) 因此代表你酵素作用不完全, 解決方式是DNA濃度降低一點, 以及在酵素反應結束後必須跑膠然後切膠回收跑膠時要放uncutted vector作為control 環狀的載體跟被切成直線型的載體比較, 跑膠效率會不一樣而且環狀質體跑膠時會有一條以上的bands 因此你回收直線的載體時, 理應看見其位置與環狀載體不同, 並且只有一條band 電泳時間不要太久, 15分鐘左右, 讓band跑在膠片上方1/3-1/4, 看得出差異就該回收了另外, 你提到當你切膠回收後甚麼都不長這代表即使你切載體的酵素反應不完全, 跑膠回收時有環狀或只被切一刀的載體時卻連帶有空載體的菌落也生長不出來表示你後面每個步驟都可能有問題...... 即使你解決了一個問題A, 但你還是會做不出來, 因為通常新手的問題都不會只有一個然後你連問題A是否獲得解決都無法知道 orz 所以我才建議你去找附近做得很順的人幫忙如果自己實驗室內沒有, 靠一下學長姐或老師去找其他實驗室的專家幫忙不然真的很難解決... 只能祝你好運 >"< 如果真的要靠自己土法煉鋼做, 你最好就一步步來確認每個步驟OK 首先PCR產物先接到TA vector或其他質體上 (你可以用Blendtaq等, 具有部分proofreading及接A-tail的PCR酵素) 如此一來你在切割insert時的效率便可增加至少你也可以確定在ligation時, 所有的insert兩側都是XhoI-HindIII tail 以類似的方式一步步解決...... 不過即使沒人幫也不用太灰心, 作cloning的優點是你只需要一個對的菌落所以當你重複改條件, 重複去作, 只要設計不是錯的, 總是會有成功一日 ^^" 加油~ : 不知道板上有沒有好心人能幫忙看看到底那邊出了問題 : 感激不盡！～～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 36.229.210.138