Re: [求救] Confocal螢光定量問題

看板Biotech (生命科學)作者HUVEC (老板！我要錢！)時間12年前 (2013/08/20 15:43)推噓2(2推 0噓 2→)

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螢光的強度，除了本身標地分子表現量的高低外，還取決於其他相當多的因素。例如不同顏色螢光的穿透性(紅色>綠色>藍色)，顯微鏡雷射與光學組件，抗體本身接合受體的能力，還有抗體上架接螢光分子的數量。針對顯微鏡雷射與光學組件的影響，我多解釋一下。 confocoal對於不同螢光是用不同的雷射，光學組件(ex. filter cube)也全不相同，所以用不同螢光標定產生出不同的螢光量是完全可想而知的，即使你已經減去所謂背景質。利用confocal的螢光作定量分析本身就不是一個很準確的實驗，即使用相同的condition(抗體相同、螢光相同、用的顯微鏡也要相同)下要比較不同的samples是否有不同的表現量，充其量只是一種 semi-quatify (我個人不相信這種實驗數據，能造假的地方太多了)，遑論你不僅改變了螢光，又改變了抗體。能得到僅有 2.2 和 2.7 的差別已經可以去廟裡還願了。或許我對你的實驗理解有誤，歡迎討論 ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之銘言： : 求救求救!!! : 之前我用confocal看雙染分子的螢光量 : 一共三個分子 A B C : 主要目的看A+B A+C的% of colocalization程度 : 第一次雙染 A (紅光,二抗是M)+B(綠光,是已經接上螢光的抗體) : 第二次雙染 A (綠光,二抗是M)+C(紅光,二抗是R) : -->我知道A應該都染同一種顏色才對 : 但因為B與C是老闆指定要呈現的顏色所以才把A的顏色換掉 : 本來想換螢光顏色應該對於其分子的螢光表現量不會差太多 : 但是現在問題來了!!! : 就是有差!! : 原本第一次雙染看三組檢體(NC,與其他兩組病人檢體) : 螢光量比例為 1:2:2.2 : 第二次染的檢體螢光比例卻變成 1:2.2:2.7 : (螢光量都已經減去各自的background了) : 難道同一個分子同樣抗體濃度 : 染色的condition都一樣的狀態下 : (從固定, blocking,一抗濃度二抗濃度,wash時間通通一樣) : 染不一樣的螢光表現量會差異到快一倍嗎??@@a : 被老闆一問一整個不知道該怎麼回答~ : 請問有concocal達人可以幫幫忙嗎?? : 有沒有甚麼解釋方法呢?? : 感激不盡!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 49.127.67.32