Re: [求救] Confocal螢光定量問題
※ 引述《HUVEC (老板！我要錢！)》之銘言：
: 螢光的強度，除了本身標地分子表現量的高低外，還取決於其他相當多的因素。
: 例如不同顏色螢光的穿透性(紅色>綠色>藍色)，顯微鏡雷射與光學組件，
: 抗體本身接合受體的能力，還有抗體上架接螢光分子的數量。
: 針對顯微鏡雷射與光學組件的影響，我多解釋一下。
: confocoal對於不同螢光是用不同的雷射，光學組件(ex. filter cube)也全不相同，
: 所以用不同螢光標定產生出不同的螢光量是完全可想而知的，即使你已經減去所謂
: 背景質。
: 利用confocal的螢光作定量分析本身就不是一個很準確的實驗，
: 即使用相同的condition(抗體相同、螢光相同、用的顯微鏡也要相同)下要比較
: 不同的samples是否有不同的表現量，充其量只是一種 semi-quatify
: (我個人不相信這種實驗數據，能造假的地方太多了)，
這倒是真的
之前也跟老闆討論說是否真的要用這種方式來呈現分子間的% of colocalization
但無奈是因為病人的檢體只比米粒大一點
要做WB, PCR, realtime PCR, microarray....
實在是無法再多浪費去做IP等實驗
只能想到這種方式來呈現
還是H大及各位版友有更精簡的方式可以指點一下
因為下一個計畫又要開始做同樣的事
挖耶起笑了......@@a
: 遑論你不僅改變了螢光，又改變了抗體。
: 能得到僅有 2.2 和 2.7 的差別已經可以去廟裡還願了。
: 或許我對你的實驗理解有誤，歡迎討論
: ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之銘言：
: : 求救求救!!!
: : 之前我用confocal看雙染分子的螢光量
: : 一共三個分子 A B C
: : 主要目的看A+B A+C的% of colocalization程度
: : 第一次雙染 A (紅光,二抗是M)+B(綠光,是已經接上螢光的抗體)
: : 第二次雙染 A (綠光,二抗是M)+C(紅光,二抗是R)
: : -->我知道A應該都染同一種顏色才對
: : 但因為B與C是老闆指定要呈現的顏色所以才把A的顏色換掉
: : 本來想換螢光顏色應該對於其分子的螢光表現量不會差太多
: : 但是現在問題來了!!!
: : 就是有差!!
: : 原本第一次雙染看三組檢體(NC,與其他兩組病人檢體)
: : 螢光量比例為 1:2:2.2
: : 第二次染的檢體螢光比例卻變成 1:2.2:2.7
: : (螢光量都已經減去各自的background了)
: : 難道同一個分子同樣抗體濃度
: : 染色的condition都一樣的狀態下
: : (從固定, blocking,一抗濃度二抗濃度,wash時間通通一樣)
: : 染不一樣的螢光表現量會差異到快一倍嗎??@@a
: : 被老闆一問一整個不知道該怎麼回答~
: : 請問有concocal達人可以幫幫忙嗎??
: : 有沒有甚麼解釋方法呢??
: : 感激不盡!!
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