Re: [閒聊] Genome editing - CRISPR/Cas9

看板Biotech (生命科學)作者kaifish (喔.....................)時間10年前 (2015/01/23 17:57)推噓1(1推 0噓 3→)

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※ 引述《silverberry (平行線上的交集....)》之銘言： : 大家好，標題用閒聊是想聽聽大家的意見。 : 如果不合適的話請告訴我，我會修改 m(_ _)m : 我的實驗室最近想要開始使用 CRISPRC/Cas9， : 除了從 addgene 買了相對應的 vector， : 為了快速地確認這個技術在實驗室是成功的， : 我們決定先把有 stable eGFP transfect 的細胞裡的 eGFP 做 deletion。 : 根據 gRNA 設計的原理， : 最後挑了四個 gRNA : gRNA1 gRNA2 : 5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3' : 3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5' : gRNA3 gRNA4 : gRNA1,2 是根據 (+) strain 設計的 : gRNA3,4 是根據 (-) strain 設計的 : 為了確定可以把 eGFP 去掉， : 除了一定要的 Cas9 以外， : 打算做 gRNA1+gRNA2 : gRNA1+gRNA4 : gRNA3+gRNA2 : gRNA3+gRNA4 四組 co-transfection : 然後再看看哪一組都不亮了、並配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 確定真的成功了。 : 設計這四組 co-transfection，合理嗎? : 還是我們想太多了? : 雖然很可能試了才知道怎麼會成功， : 不知道有沒有人可以分享一些經驗^^ : 謝謝 m(_ _)m 首先，利用Cas9破壞EGFP表現的原理是造成insersion or deletion 然後讓EGFP序列發生frameshift，破壞正常胺基酸序列但有時候Cas9造成的insersion or deletion恰好是3n，所以inframe的結果是EGFP繼續亮其次，因為是transient表現的細胞，所以plasmid在細胞的copy number比較多就算Cas9逃過了第一點，也很可能因為只切了30%的plasmid，所以EGFP繼續亮所以，我擔心你的實驗設計無法告訴你太多資訊比較好的做法是找一個endogenous gene 利用T7E1 assay確定efficiency就好這樣才有機會比較快知道這套系統能不能在貴實驗室作用我自己是用這個方法進行，也沒有什麽太大的問題比較多的經驗是做成conditional KO mice及point mutation KI mice 如果大家有興趣，我們可以再討論 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.133.10 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422007069.A.D55.html ※ 編輯: kaifish (140.112.133.10), 01/23/2015 18:16:11