Re: [求救] Cloning

看板Biotech (生命科學)作者licat (licat)時間9年前 (2015/11/26 00:19)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《aaa111bb2 (Nate)》之銘言： : Cloning 相關問題 : Vector為10K , RE 相距 9bp, 分別為 SNABI 及 NHEI (Sticky end and blunt end) : NEB, smart buffer 取vector 1ug同時切兩刀 o/n DNA濃度跟純度OK的話,切滿個2 hr就很夠了, 放久有些酵素還會亂切 : Insert 是chromosome PCR product 約 1.1K, 有major band , 而Primer有各預留 2bp 及 6bp. : 跑完0.8%膠, 後進行clean up : 利用NEB Quick ligation (Molar ratio: 1:7) 10 mins insert兩端是blunt end? 是的話接不進去啊... ligation可以作用久一點 : Transformation on ice 20 mins, heat shock 42度 45秒, on ice 5 mins : Add S.O.C medium 500ul and incubation 1h 37度 : 取 200ul 塗盤能用電穿孔的話, 效率會更高 : 失敗…已經試很多次失敗是都沒長? 還是長很多vector only? 關係到你後續trouble shooting要往哪 : 沒有任何中繼站可以進行Check, vector 切完也看不出來我會把insert先接到TA vector上, 至少之後切下來後可確定insert兩端是我要的樣子要找出問題的話, 你要在不同階段多做一些控制組, 不過新手的話, 通常出錯點不會只有一個 : Ligation完 10K->11K 也很難看得出來 : 不知道有沒有高手使用過這兩種RE????或是可以給點建議因為可能出錯的點太多了, 如果你急著要得到這個clone 我的建議是找附近cloning做得很順的人幫忙, 沒必要卡死自己研究如果你有好好磨練自己技術跟邏輯的時間跟決心, 那就可以一步步找出問題在哪 Good luck -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.142.73.161 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1448468342.A.B1F.html