Re: [求救] PCR問題以及plasmid濃度換算

看板Biotech (生命科學)作者Ice9 (又到了屬於我的季節)時間9年前 (2016/02/15 19:42)推噓0(0推 0噓 0→)

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1. 拿 HBV 當模板，應該是指 virus genome 來當做來源。而且你在後面也說到你們一般是以 copies/ul 來當作計量單位，這通常是已經使用其他 PCR 方式測出 titer 的樣本，像是 q-PCR等等。而 10^8 copies/ul 這種標示，應該是準備拿來感染細胞或動物之類的基準量。但說實在的，一般 PCR template 並不會拿這麼多，一定會再稀釋。 2. 拿 plasmid DNA 當模板，是因為一般 PCR 放大是準備看特殊片斷，特別是已經被研究過的對象。你之所以提到 plasmid DNA，是因為有其他學姊和你說。我猜她是在幫你釐清你的問題，所以才會建議拿個 plasmid 來測。一般建議拿 plasmid DNA，是因為我們在研究過程中經常會將有興趣的 DNA 片段塞到適合的 plasmid DNA 之中。而學姊的建議應該是拿一個含有你要放大片段 (片段是來自於 HBV) 的 plasmid DNA 來當模版，而不是一個含有整個 HBV genome 的載體。Plasmid DNA 的品質可以比較純，所以拿來當 PCR 時的模板就可以減少誤差，也可以用來檢驗 PCR 條件。Plasmid DNA 的製備，一般是使用 E.coli，經濟和技術方便性考量。 3. 你家 primer 不可能長到 400 nt. 以上，你應該是記錯了，它比較像是你 PCR 產物的大小。特別是像 HBV 這個被研究了很久的病毒，很多偵測用的 primers 可以從相關文獻得到，不用再特別設計，除非有其他特殊的實驗需求。同時，PCR 條件可以參考那些文獻來進行。而你看到的應該就是 primer dimers 的訊號，要重新調整 PCR 條件，或是重新訂購/設計 primers。一般不會有什麼大問題。有問題的大概就是東西品質和技術。前面也有網友提供其他意見，如果是機台問題，那是機台要修了。實驗室最好是有學長姊可以問，要不然問老闆也行。沒有學長姊可以當場問的話，那會很辛苦。 4. 單位的換算，你可以把 plasmid DNA 的一般計量從 microgram/ microliter 換算成 copies/ul，但其他領域一般不會這樣做。在你檢驗 PCR 條件的時候，似乎也沒必要這麼做。如果是其他 PCR 條件，那問題並不在於你要不要換算單位。 == 要看 PCR 條件，就拿個 plasmid DNA 來測試。你們實驗室有 HBV genome DNA，那應該也多多少少也能取得相關的 plasmid DNA 來當測試模板。拿 viroids/virus particles 或以 copies/ul 為計量單位的樣本，感覺有點浪費又有些危險。你的問題應該是在於相關的 PCR 條件，目前看來應該是機器的關係，先從那裡看看吧。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 27.51.1.222 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1455536563.A.B70.html

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