[求救] 有關gene knockout-使用sacB基因篩選疑問

看板Biotech (生命科學)作者angel810801 (陰雨綿綿)時間9年前 (2016/05/01 20:58)推噓1(1推 0噓 0→)

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各位版大好，小的目前在做的是要將vibrio屬的細菌做gene knockout 由於是knockout新手還請各位幫忙看看是不是有哪部分的思考出錯了QAQ 使用的donor strain是E. coli S17-1 自殺載體的部分是用pk18mobsacB 目前做到的部分是透過PCR將目標基因的上下游各1000bp 接到pk18上後轉型至S17-1內之後將S17-1和vibrio隔夜培養的菌液1:1混合塗抹在TCBS+kan(30 ug/ml)培養基上培養O/N 成功生長的是所謂的單交換成功吧? 因此我挑選單一黃色菌落劃線分離於TCBS+10% sucrose 培養基上依我之前看的paper理解長出來的菌應該會是同源重組雙交換成功的菌(kan敏感以及sucrose抗性) 但隨後我將colony劃線分離於LA+kan 以及 LA+10% sucrose 結果兩者都有菌落生長然後我將LA+10% sucrose上的菌去做目標基因的PCR 發現基因還在代表我knockout 失敗這邊我疑惑的點是如果沒有交換成功菌體內plasmid上的sacB不是應該還存在嗎? 那又為何會在sucrose plate上生長呢? 然後我將LA+kan上的菌用LB+10% sucrose培養過了三天了還是很清澈這樣是表明其實sacB是有作用的@@? (當初我有將S17-1含pk18 拿去劃線在LA+10% sucrose plate 結果長得好好的因此我才懷疑我的sacB是不是沒有作用?) 假設sacB有作用的話....那有什麼辦法可以增加他交換的機率嗎? 又或者一開始單交換那裏根本沒有成功? 菌株會有kan抗性是因為plasmid在裡面但是並沒有嵌上chromosome? 以上打得有點混亂不好意思 ps.建構好的pk18 我一直沒辦法PCR出我插入的2000bp片段可是分別1000去PCR(分別使用上游跟下游的primer) 卻都有產物讓我有點困惑(使用的溫度條件都一樣 55度 10 cycle -> 58度 20 cycle) 各位有什麼建議歡迎提供> < -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.121.155.195 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1462107509.A.273.html ※ 編輯: angel810801 (140.121.155.195), 05/01/2016 20:58:58