[求救] his-tag純化蛋白

看板Biotech (生命科學)作者s992003 (Lord of Ethanol)時間8年前 (2017/01/16 18:23)推噓3(3推 0噓 3→)

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不常發文，排版差見諒小弟最近在重複學姊的實驗，用His-tag純化蛋白但是不管怎樣都不純，蛋白量也不多實驗條件是先以含有表達序列的pET28a 載體放入BL-21菌株中接著塗盤篩選挑菌放入含有50ug/mL的LB broth中培養16小時接著各加5mL的菌液到兩瓶500mL的LB broth中培養至600nm OD=0.5~0.6 再加入IPTG使最終濃度為1mM 刺激表達蛋白4小時收菌以10000g離心30分鐘，用50mL的buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1mg/mL Lysozyme,1mM DTT,0.2mM PMSF,1% Triton pH=8) 將1L的菌 pellet沖起，凍入-80°C到隔天沖水快速解凍後，冰上sonication 5分鐘(on 30s off 30s，共10分鐘) 接著與1mL NTA-beads於離心管中搖晃binding 1小時收集beads之後填入管柱中接著以50mL的10mM imidazole,50mM NaH2PO4,300mM NaCl的buffer沖洗再以30mL的20mM imidazole沖洗再以20mL的30mM imidazole沖洗再以10mL的40mM imidazole沖洗再以10mL的60mM imidazole沖洗接著以4mL的250mM imidazole elute 收集清洗液40mM,60mM前面500uL 以及5管elute溶液 250mM 700uL跑膠目標蛋白:紅框裡面，綠色及藍色ladder中間那條，約30kD 結果60mM看起來清洗掉很多雜蛋白但非常不純附圖:左到右40,60,250,250,250,250mM imidazole http://imgur.com/a/wlLg5 後來老師認為既然雜質蛋白太難洗掉，那降低pH值降低所有蛋白對NTA-beads的親和力反正含有His-tag的蛋白應該還是會牢牢的吸附在beads上此外也不要搖晃binding 1小時，改用流過beads的方式binding就好，減少雜蛋白和beads作用的時間因此新的條件將所有buffer改成pH=7.5 此外老師認為pH=7.5之下蛋白比較容易掉下來，所以清洗的gradient應該要改，鹽類濃度也可以降低所以imidazole洗到50mM就好，並且elute的NaCl濃度改成150mM 後面elute改成各用1mL的60,80,100,120,140,250mM imidazole 結果看來50mM清洗效果不佳，純化的結果更加不純附圖:左到右50,60,80,100,120,140,250mM imidazole http://imgur.com/a/tkv0g 小弟對於自己的情況有一些問題首先老師表示: 正常來說His-tag純化 30mM imidazole濃度就應該會把雜質洗掉，再提高濃度會把目標蛋白也洗掉，一定是我的蛋白表現量不好再來就是因為管柱是用人工填充的，也是手動控制流速，老師認為這樣再現性本來就不佳，要我操作更加謹慎但表現量是學姊已經測試過的，難道是後來我再做，凍在-80的菌株已經不健康了? 另外我跟老師表示NTA-beads的protocol本來建議用pH=8,300mM NaCl進行實驗，但老師認為protocol是死的，人是活的，不要太重視它可是現在做了幾次下來，都是原先的pH=8,300mM NaCl看起來效果最好我又表示那如果我用2L的菌液去純化，增加目標蛋白的總量去填滿bead的空間使雜蛋白不易吸附，而且目標蛋白增加，也可以用稍高濃度的imidazole清洗，儘管目標蛋白有流失，最終也可以以量取勝但老師認為如果我表現量不佳的話，就算增加表達的菌液培養量，目標蛋白佔細菌總蛋白的比例還是不變，情況並不會有所改善 NTA-beads是Qiagen的 http://imgur.com/a/z7RfY his-tag純化已經是個很常見的方式了吧，想請問有做過的大大們這方面的經驗如何呢?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.128.123.73 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1484562216.A.3A3.html

推

huangsw

01/16 21:58, , 1^F

01/16 21:58, 1^F

→

huangsw

01/16 21:59, , 2^F

01/16 21:59, 2^F

推

liuse

01/17 10:21, , 3^F

01/17 10:21, 3^F

謝謝大大的建議因為是重複先前的實驗，所以會一直參考前人的做法我發現之前的學姊似乎沒有比較induction前後的差異，但是因為實驗室之前有純化過其他蛋白，所以大家都不懷疑這樣的induction條件，只擔心inclusion body是否產生，但是學姊之前的測試結果是沒有inclusion body，也能夠純化出蛋白如果說induction條件真的不好，我有甚麼地方能改進呢，畢竟IPTG濃度已經用到1mM了，感覺只能增加表達時間? 然後因為沒有inclusion body所以並不需要改變溫度? 不過說到底老師還是一直認為是清洗的步驟不好QQ~但我已經沒招了 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/17/2017 15:29:22