Re: [求救] his-tag純化蛋白

看板Biotech (生命科學)作者s992003 (Lord of Ethanol)時間8年前 (2017/01/17 19:20)推噓3(3推 0噓 7→)

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※ 引述《huangsw (Orz)》之銘言： : 43 : : 謝謝大大的建議 : : 因為是重複先前的實驗，所以會一直參考前人的做法 : : 我發現之前的學姊似乎沒有比較induction前後的差異，但是因為實驗室之前有純化過其他蛋白，所以大家都不懷疑這樣的induction條件，只擔心inclusion body是否產生，但是學姊之前的測試結果是沒有inclusion body，也能夠純化出蛋白 : : 如果說induction條件真的不好，我有甚麼地方能改進呢，畢竟IPTG濃度已經用到1mM了，感覺只能增加表達時間? 然後因為沒有inclusion body所以並不需要改變溫度? : : 不過說到底老師還是一直認為是清洗的步驟不好QQ~但我已經沒招了 : 前人種樹後人乘涼, 但是難免有種歪的時候, 導致後人被壓傷, 這在科科界時有所聞. : 另外, 操作的手法也有可能會造成差異. : https://goo.gl/zMzalH : 請看上面這張圖, 理想的induction(中文應該是誘導?), : 應該要可以達到這張圖Lane 1 2的樣子(未純化). : induction本身牽扯到細菌的生長與複製, 意味著可以改的地方也有很多. : 不僅僅是IPTG和OD=0.5~0.6這兩個條件而已, 其實溫度也可以改. : 但是在做這些事情之前, 我覺得還是要先確認一下這個菌株仍有大量表達的潛力. : 如果沒有, 又想把事情做好的話. 那就砍掉重練. : 先把現在BL21的plasmid抽出來, 定序一下, 確保nucleotide是正確的. : (如果你找的到DH5alpha的菌株也行, 通常都用這個保存plasmid) : 然後重新tranform(轉形)到DH5alpha與BL21 並且妥善保存. : BL21的部分, 從transform的塗盤中, 挑選數個候選人(candidate)進行表現量的測試. : 挑到產量好的, 再去做induction的測試 (搞不好這時候就不用做條件的修改了). : 先確認有大量表現, 版友才好繼續幫你抓藥. : 如果有不懂的地方, 多看看paper也許會看到有用的資訊. : Good luck. 謝謝大大們的建議，我已經開始進行有無induction的比較我的認知是如果要增加表現量就是增加induction時間,IPTG濃度,表現溫度其他條件的改變(譬如低溫長時間表現)只是要避免inclusion body的產生不知道這個想法是不是錯的 plasmid的序列之前已經定過所以沒問題然後BL-21挑表現較好的菌這步驟學姊做過，我目前是拿他挑的菌來用(約一年多前，都冰-80) 取菌方式是用tip沾一點丟入LB，保存的菌瞬間冰回去還是其實菌並不能保存這麼久? 不過不管怎樣如果測試結果真的是無法大量表現小弟會聽從建議打掉重練 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.128.123.73 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1484652037.A.7FA.html