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看板Biotech (生命科學)作者 (opport)時間4年前 (2020/08/19 16:25), 編輯推噓17(17推 0噓 43→)
留言60則, 8人參與, 4年前最新討論串1/2 (看更多)
小弟我最近把我要的insert成功轉到vector上，但後來我要開始準備純化的東西，發現我 的insert N端掛了his-tag，然後vector上C端也有his-tag，不知是否會影響蛋白表現或 者是更後面的血清學測試 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.73.90.73 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1597825540.A.63D.html
推
08/19 16:38, 4年前 , 1F
看paper之前有沒有人這樣做過 ，還有表現出來的protei
08/19 16:38, 1F
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08/19 16:38, 4年前 , 2F
n的activation site是否在附近，真的沒資料可查保險一
08/19 16:38, 2F
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08/19 16:38, 4年前 , 3F
點把tag拿掉接著做下去，有餘力可以順便比較有無tag的
08/19 16:38, 3F
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08/19 16:38, 4年前 , 4F
優劣處。
08/19 16:38, 4F
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08/19 16:54, 4年前 , 5F
感謝大大回覆，那拿掉有什麼方法可以做嗎？
08/19 16:54, 5F
推
08/19 21:39, 4年前 , 6F
scarless cloning
08/19 21:39, 6F
推
08/19 22:50, 4年前 , 7F
\吉噗森/
08/19 22:50, 7F
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08/20 01:45, 4年前 , 8F
doi.org/10.17863/CAM.45825 不才小弟剛好博論有一章
08/20 01:45, 8F
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08/20 01:45, 4年前 , 9F
講這個 歡迎使用 第四章
08/20 01:45, 9F
推
08/20 12:34, 4年前 , 10F
site-directed mutagenesis
08/20 12:34, 10F
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08/20 18:22, 4年前 , 11F
如果實驗室還沒有建立gibson/sdm的話 建議用SLIC啦
08/20 18:22, 11F
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08/20 18:23, 4年前 , 12F
便宜又好用 詳情請參上面留言
08/20 18:23, 12F
推
08/20 18:56, 4年前 , 13F
我是跟NEB要了根試用..省省的就作了10個Clone.
08/20 18:56, 13F
推
08/20 19:09, 4年前 , 14F
NEB的SDM很快，而且幾乎不會失敗，另外KLD可以自己配XD
08/20 19:09, 14F
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08/20 19:14, 4年前 , 15F
SLIC的話，可google關鍵字"HAC"，五分鐘內搞定
08/20 19:14, 15F
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08/20 19:16, 4年前 , 16F
連T4pol都不想買的話，in vivo assembly，全都讓E.coli幫
08/20 19:16, 16F
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08/20 19:16, 4年前 , 17F
你代工
08/20 19:16, 17F
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08/20 19:18, 4年前 , 18F
關鍵字"AQUA cloning"，不過全E.coli代工的話效率較差就
08/20 19:18, 18F
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08/20 19:18, 4年前 , 19F
是了
08/20 19:18, 19F
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08/20 19:18, 4年前 , 20F
也是怕self ligation 我用的心得是gibson放幾個月後fa
08/20 19:18, 20F
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08/20 19:18, 4年前 , 21F
lse positive忽然變超高 滿盤全部都是blank
08/20 19:18, 21F
推
08/20 20:56, 4年前 , 22F
gibson的話也有modified版，關鍵字"Hot Fusion"，少了Ta
08/20 20:56, 22F
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08/20 20:56, 4年前 , 23F
q ligase，成本省很多
08/20 20:56, 23F
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08/20 20:58, 4年前 , 24F
該篇作者也說false positive降很多，重點是便宜很多XD
08/20 20:58, 24F
推
08/20 21:09, 4年前 , 25F
其實t4p很強而且沒有strand replacement 做完anneal再
08/20 21:09, 25F
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08/20 21:09, 4年前 , 26F
丟dNTP就開始fill in了
08/20 21:09, 26F
推
08/20 21:39, 4年前 , 27F
HAC那篇也超快，T4p一分鐘，EDTA stop，anneal一分鐘，送
08/20 21:39, 27F
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08/20 21:39, 4年前 , 28F
細菌，交給細菌補gap…XD
08/20 21:39, 28F
推
08/20 21:42, 4年前 , 29F
insert不多的話，SLIC真的好用XD
08/20 21:42, 29F
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08/20 22:55, 4年前 , 30F
除非這ligation很難做 不然重P一下在黏回去可能最簡單
08/20 22:55, 30F
推
08/21 01:42, 4年前 , 31F
是說如果 insert自帶 stop codon, 那根本不用管C-ter
08/21 01:42, 31F
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08/21 01:42, 4年前 , 32F
的his吧?
08/21 01:42, 32F
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08/21 02:29, 4年前 , 33F
我construction 做了七次，是真的有點難做，但指導教授
08/21 02:29, 33F
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08/21 02:29, 4年前 , 34F
說我的insert的頭如果是ATG（蛋白質MET)的話，其實沒什
08/21 02:29, 34F
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08/21 02:29, 4年前 , 35F
麼影響，這我不知道是不是真的XD
08/21 02:29, 35F
推
08/21 06:24, 4年前 , 36F
其實你玩過一次seamless cloning就不會想再用RE切黏了，
08/21 06:24, 36F
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08/21 06:24, 4年前 , 37F
很難失敗
08/21 06:24, 37F
推
08/21 06:32, 4年前 , 38F
無論Gibson、Infusion、LIC、SLIC、OEC、CPEC、IVA，都是
08/21 06:32, 38F
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08/21 06:32, 4年前 , 39F
overlap15~25bp去黏，比起RE短短的切位黏，成功率高太多
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08/21 06:32, 4年前 , 40F
了
08/21 06:32, 40F
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08/21 16:10, 4年前 , 41F
主要是受惠於現在 1. 引子便宜的跟水一樣 2. 現今的
08/21 16:10, 41F
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08/21 16:11, 4年前 , 42F
PCR 用 high-fidelity DNA polymerase 便宜又幾乎不出
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08/21 16:12, 4年前 , 43F
錯，不像以前標榜 HF 還是錯一堆。
08/21 16:12, 43F
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08/21 16:13, 4年前 , 44F
可是在傳統 RE 法長大的教授和一些學生還是會覺得 PCR
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08/21 16:13, 4年前 , 45F
做的東西不定序不安心，而且 RE 還是比新一代的方法便
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08/21 16:14, 4年前 , 46F
宜很多(雖然要看用什麼RE)，單純的把 insert 從A質體換
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08/21 16:15, 4年前 , 47F
到B質體也是RE比較安定。
08/21 16:15, 47F
推
08/21 16:57, 4年前 , 48F
借問x大 哪家的hifi便宜啊XD
08/21 16:57, 48F
推
08/21 18:36, 4年前 , 49F
自己覺得 KOD便宜大碗 (？)
08/21 18:36, 49F
推
08/21 22:52, 4年前 , 50F
的確，不過有的老教授那種先TA挑數十顆菌，再轉RE挑數十
08/21 22:52, 50F
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08/21 22:52, 4年前 , 51F
顆菌，切O/N，ligationO/N的，那個花費的時間與消耗的其
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08/21 22:52, 4年前 , 52F
他耗材，我是覺得沒便宜到哪裡就是了XD
08/21 22:52, 52F
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08/22 02:34, 4年前 , 53F
RE我也還是習慣o/n，雖然測過知道10～30分就夠了但是
08/22 02:34, 53F
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08/22 02:34, 4年前 , 54F
還是不切整晚不安心XD，ligation倒是室溫十幾分就拿去
08/22 02:34, 54F
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08/22 02:34, 4年前 , 55F
轉了。HF pol 我家用Phusion不算便宜，我說便宜是和7
08/22 02:34, 55F
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08/22 02:34, 4年前 , 56F
、8年前比，我個人覺得HF pol 是很神奇的，每個人用起
08/22 02:34, 56F
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08/22 02:34, 4年前 , 57F
來覺得好用的可能都不一樣w
08/22 02:34, 57F
推
08/23 03:57, 4年前 , 58F
有錢當然直接畫好map叫公司合成啊XD 太長的我還是覺得用RE
08/23 03:57, 58F
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08/23 03:57, 4年前 , 59F
比較穩. 我反而覺得切快一點 ligation丟4度o/n感覺比較舒
08/23 03:57, 59F
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08/23 03:57, 4年前 , 60F
服(懶).. HF我覺得AccuPrim很棒啊 Phusion跟我tone不合XD
08/23 03:57, 60F
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0
14
Re: 質體
jasontang
4年前, 08/25
完整討論串 (本文為第 1 之 2 篇)：
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17
60
質體
nm768417
4年前, 08/19
0
14
Re: 質體
jasontang
4年前, 08/25
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