Re: [求救] stable transfect的螢光表現

看板Biotech (生命科學)作者maurice9325 (水色天秤)時間11月前 (2024/01/05 09:16)推噓0(0推 0噓 3→)

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因為話多一點，所以回覆一篇討論。首先先談我的經驗與方法。我的經驗是還是要從single colony 去挑出stable clone容易很多。細胞適應抗生素活下來變成抗藥性細胞真的沒那麼難，且不帶過量表現蛋白往往長得比會表現過量蛋白來得好與快，幾次繼代後就沒有了，所以容易挑出只有抗藥性的細胞。你的clone有帶螢光，我的經驗來說從單一細胞挑不是很難挑。Transfection後一到兩天從顯微鏡下看到有螢光，直接算500或1000顆同時含有G418分種在96 well，大概1週後用螢光顯微鏡觀察，後續挑出只有長出一個clone且帶螢光的well再放大，最後以WB確認ove rexpresstion即可。那回到一開始的問題，細胞產生抗藥性的方法或產生基因靜默的可能性很多，如果真的想知道之後再做討論吧。但我相信這不是你當下想解決或是深究的重點，對你的後續實驗也無益，所以先暫時忘了它吧。再來延伸出去的我想討論的是“stable clone” 這件事，我遇到過有的老闆會認為挑出s ignle colony的細胞不能完全反應這個細胞株的生理特性，因為這是“這顆細胞自己”在受到強大的逆境後所產生出的新的特性，而不是“這群細胞”所表現出的特性，所以他們反對這種做法。我自己在投稿也遇過reviewer針對我每個用“stable clone”的圖提出質疑，哪怕我已經用3個不同的stable clone驗證我的結果，他revise每個“stable”也都刻意標引號，最後我只好再以transient expression補一些實驗他才放我過。但不是每個人都會在意這點，不論是一群或是單一細胞的stable cell line我覺得還是先求有再求好。最後，要用什麼樣的細胞株進行後續實驗仍取決於你的老闆是否接受，所以跟他討論看看吧。有螢光的細胞株要挑不會太難，所以別太氣餒。以上碎碎唸供參。 ※ 引述《belzy (zy)》之銘言： : Transfect新手研究生 : 要做overexpressed stable cell line，Insert 後面接紅色螢光當標記（有IRES也有直? : 做fusion的組別) : 之前有先測試g418的濃度（800ug/ml) : 現在遇到的問題是，在篩選之後有一些不會表達螢光的細胞長得很好，跟有螢光的混在一 : 分不開，是因為我一開始篩選的時候細胞不夠散嗎？ : 分盤之後再篩，沒有螢光的依然長得很好，已經會長得很均勻而不是團塊的樣子，還是沒 : 法只把有螢光的細胞分出來 : 想請問那些沒有螢光卻活下來的細胞，是螢光的promoter沒有被推動但是g418的promot er : ，還是篩出了有抗藥性的細胞？？還是其他原因？ : 還想請問我現在這個狀況有什麼補救的方法嗎？ : 感謝各位前輩們 : 在stable cell line卡好久卡到想休學了…orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.12.27.103 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1704417367.A.74E.html