Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起

看板Biotech (生命科學)作者timbrian (perk yourself up)時間20年前 (2005/05/23 00:58)推噓3(3推 0噓 0→)

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※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : : 講仔細一點我們的構想 : : 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響 : : 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray) : : 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變 : : 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此 : : 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa : : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling : : 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling : : 分別純化出來看能不能再結合為 full length protein : : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變 : : 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去 : : 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位 : : 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端與 C端接在一起就是個大挑戰 : : 因此 fusion 的辦法似乎是不可行 : : 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者 : : DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5' : : 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端 : : ubiquitin 結合的機制好像也不適用 : : 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain : : 也會任意的鍵結在一起 : : 有沒有知道其他方式可以做的阿 : : 還是這本身就是個很難的題目?... : 嗯那如果這樣呢 : 把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide : 然後再用DNA ligase接起來.... : 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用如果可以的話 good idea 但是這有一個問題 (因為這方法我想過) 即便是兩各蛋白質成功接上DNA or RNA 再是利用ligase把他接在一起我認為可能性不高 1. DNA 或 RNA 不能過長太長兩個 domain 就沒法子回覆一起整各實驗就沒意義了 2. 太短 ligase 要接合兩段 DNA 或 RNA 中間不能有立體障礙的但是兩各蛋白質本身就是各無比大的立體障礙 ligase 再反應時會被兩各蛋白質所阻擋所以我認為機會不大 : 否則就分別分開兩個domain做labelling : 然後用化學合成peptide的方式 : 把兩個domain以一級結構的方式合成再篩選 : 不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA : 以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起 : 好吧我承認我是來亂的可是這是我認真想出來的化學合成peptide 的方式太過劇烈在peptide bond 合成完前..我的兩蛋白質早以 denature 且越大越複雜的蛋白質越不好 renature.. 另一個問題是 peptide synthesis 需要以t-Boc保護 amino group, 但是蛋白質本身不只有 N 端有amino group 像 lys, Arg 等表面上的胺基酸的 R gruop 都帶有 amino group 這些都會使反應 nonspecific 如果以一級結構的方式 solid phase 合成peptide 再結合在一起那別說15 kDa 的蛋白質了只怕 5 kDa 的蛋白質都無法合成出來且以此合成效率 (越長越低) final 不可能用以 NMR 來測蛋白質結構的 (NMR 測 protein 所需濃度極高) 不過非常謝謝你的建議希望您有更新一步的想法供我們做參考 Gratefully yours -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.204.140.176