Re: [問題] 請問大家 有關分離核質prorein的方法
※ 引述《lotany.bbs@bbs.badcow.com.tw (可愛女孩)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (有氣質的台客)》之銘言：
: : 我用PIERCE的KIT可以分的很乾淨，但是他的KIT很貴
: : 所以若不是非常要求，我用土法即可以收到純度還不錯的核蛋白
: : 若你要土法的步驟，再跟我講
: 可以跟大大要一下protocal嗎
: 我也再做這部份實驗 但是一直分不乾淨 謝謝
: 信箱是 flylerd@hotmail.com
抽核蛋白
1.細胞以cold PBS wash
2.離心 4000rpm/5min at 4℃
3.以extraction buffer將細胞打散
*extraction buffer
[10 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、20% glycerol、
0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
4. 置冰上15分鐘
5. 以針筒+針頭『吸放』cell藉以打破細胞
6. 離心14000 rpm/1min
7. 去除上清液(上清液為cytosolic protein)
8. 沉澱物以nuclear extraction buffer打散
﹡nuclear extraction buffer
[500 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、10% glycerol、
0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
9. vortex 最高轉速15sec/10min 3~6次，期間至於冰上
10. 14000 rpm/5 min at 4℃，上清液為nuclear extract
11.測蛋白質濃度，分裝存放於-80冰箱
這個方法會有些抽到cytosolic protein
有以tubulin為negative control做過測試
但是跟cytosolic part的tubulin比起來差很多
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07/18 19:50, , 1F
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推
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