Re: [問題] 請問大家 有關分離核質prorein的方法
※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：
: ※ 引述《lotany.bbs@bbs.badcow.com.tw (可愛女孩)》之銘言：
: : 可以跟大大要一下protocal嗎
: : 我也再做這部份實驗 但是一直分不乾淨 謝謝
: : 信箱是 flylerd@hotmail.com
: 抽核蛋白
: 1.細胞以cold PBS wash
: 2.離心 4000rpm/5min at 4℃
: 3.以extraction buffer將細胞打散
: *extraction buffer
: [10 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、20% glycerol、
: 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
: 4. 置冰上15分鐘
: 5. 以針筒+針頭『吸放』cell藉以打破細胞
: 6. 離心14000 rpm/1min
: 7. 去除上清液(上清液為cytosolic protein)
: 8. 沉澱物以nuclear extraction buffer打散
: ﹡nuclear extraction buffer
: [500 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、10% glycerol、
: 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
: 9. vortex 最高轉速15sec/10min 3~6次，期間至於冰上
: 10. 14000 rpm/5 min at 4℃，上清液為nuclear extract
: 11.測蛋白質濃度，分裝存放於-80冰箱
: 這個方法會有些抽到cytosolic protein
: 有以tubulin為negative control做過測試
: 但是跟cytosolic part的tubulin比起來差很多
忘了說，針頭size最好用25g的....
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