Re: [問題] Real-Time的問題(也有PCR的問題)

看板Biotech (生命科學)作者LBP (幸福已經從指縫間溜走)時間19年前 (2006/09/14 16:32)推噓4(4推 0噓 4→)

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※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : ※ 引述《LBP (幸福已經從指縫間溜走)》之銘言： : : 原本我的real-time一直都做的好好的 : : 結果自從有一次跑出來的Ct值忽然很低 : : 之前都在28-30之間 : : 那一次突然變成20上下 : : 我就把real-time的產物拿去跑膠看看是哪裡有問題 : : 跑出來的結果發現產物竟然不是single band... : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 不是single band的話 : 我會懷疑你的PCR已經有contamination的現象了 : 是否有的plate/tube沒有封好,在高溫的情況下PCR產物隨著蒸氣飄散在block : 然後又跑到你的plate/tube裡 : 甚至在你prepair的時候,你所用的東西器具就已經有PCR產物的汙染了 : (PCR可是很可怕的,只要一點點就可以不斷放大啊) 嗯...你說的這個情況我想暫時是可以排除的我使用的是ABI原廠8tubes per strip 蓋上caps時也是用它專用的黑棒棒(不知道這個叫什麼^^") 所以密封度我想是沒問題的另外我忘了提到原本都做的出來的real-time，開始出現問題後我repeat了好幾次都一直出現相同的問題--過低的Ct值以及雜band的電泳結果此外，原文mandible推文提及我原本所謂有做出來的Ct值是否過高(28-30) 我想應該是還在可以接受的範圍內因為欲增幅的這個片段在一開始的PCR結果中表現就已經偏弱了於是在real-time會得到偏高的Ct值，我個人覺得是合理的 (如果這樣的想法有誤請給予指正 ^^" ) : 我看到這裡,覺得比較像環境上的污染而非機器污染 : 如果是我,我會連pipetteman都仔細清過(用酒精擦拭,恐怕連內管都要處理一下), : tip也改用filter tip... : 不果我想問一下,你跑膠出來的結果不是single band而是怎樣的情況啊? : 是多一條band? 還是變成smear? : 如果是多一條band,而且在hTERT跟internal control都有一樣大的band出現 : 那我的推測應該就獲得證實了... : 希望可以幫上忙,也歡迎討論. 我想你的推測應該是對了因為我今天仔細看著之前的電泳圖發現前幾次的結果中，hTERT跟internal control隱約有著一樣大小的雜band 然後今天重新換了reaction buf.和dNTP也是出現雜band 我目前是想說可能連最根本的水是污染的剛剛重新用新拆封的水去稀釋cDNA和primer 希望明天可以看到漂亮的data >_< 要是再出不來我也束手無策了吧 T__T -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.29.223.14