Re: [問題] Real-time PCR

看板Biotech (生命科學)作者rpr (Cathy)時間19年前 (2006/12/16 20:53)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《lakerjackt (NN )》之銘言： : ※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : : PCR有一個重要的公式 : : y=(1+e)^n e是PCR反應的效率,而n次方指的就是cycle number : : 就我所知real-time PCR,是希望每一個PCR反應能盡量達到 e=100% : : 所以才會限制產物大小 (<250 bp) 跟反應溫度(2-step PCR) : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 請問一下...你說的這限制是針對於real-time嗎? 是的,real-time PCR的產物大小是要限制在250 bp以下的這個在設計primer的primer express軟體裡面已經內建好了限制當然也有得改啦,不過有人做過超過300 bp以上的反應就已經不太好了所以我的產物大小都控制在100-200 bp : 其實用kit抽,是怎麼抽都抽的出RNA....問題我想就如我那時ABI : 跟我說出在轉cDNA,因為RT我並是用kit,而是各家廠商東奏西奏去轉的... : 其實,我覺得不是操作的問題....操作的基本手則大家應該都一樣, : 感覺問題不大... 嗯! 我所說的操作問題是指在轉cDNA時候的細節之類的不是說real-time的操作,因為上機實在沒有什麼可以影響的了 : 其實我現在比較想知道,若是cDNA沒轉好,導致PCR做的出來而q-PCR做不出來.. : 除了重抽外,有啥補救措施....拜託各位高手(因為我的檢體不太可能再重抽了..><) 你用多少RNA下去轉cDNA? 然後應該有稀釋5倍吧! 你的real-time PCR用了多少這樣的cDNA去做呢?(有時下太多也會有問題喔) internal control是什麼? Ct又是多少? 因為你是用kit抽的,基本上如過連這些資訊得到的資料都沒有問題的話我想真的有點難救... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.204 ※ 編輯: rpr 來自: 163.15.174.204 (12/16 21:08)