Re: [問題] Real-time PCR
※ 引述《mandible (生化...go go go !!)》之銘言：
: ※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言：
: : 其實,抑制物這個問題也不是無法可解
: : 主要就是減少template 的量
: : 但是咧,這又牽涉到你的template濃度的問題了
: : 雖說real-time PCR最少可以偵測到的RNA在pg等級(應該沒記錯)
: : 但是你的template濃度到底要下多少,這恐怕要稍微考慮一下
: : 下的多,template跟抑制物的量都會高
: : 下的少,兩個量也都會少
: : (其實跟我的實驗的煩惱好像喔...)
: : 加上試劑又貴,也不敢多試很多種...
: : 只能說
: : Good Luck to you
: 想請問你r大
: 你在做q-pcr時
: 利用RNA做PCR作為NEGATIVE CONTROL時
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 是否有偵測到螢光?若有Ct大約為多少?
:
不好意思呢! 我不太了解你的意思
你是指NTC(no template control)呢?
還是指NPC(no probe control, 指沒有放入TaqMan probe, SYBR green系統不適用)?
但是依照理論
不管是NTC or NPC,在TaqMan系統或者SYBR green系統下都不應該被偵測到
(這樣才是negative control啊!)
如果在NTC or NPC有偵測到螢光就要考慮很多事情了
包括TaqMan probe解離,PCR污染, non-specific band, primer dimer等
(前兩者適用TaqMan系統,後三者適用SYBR green系統)
其實這些都可以在實驗的amplification curve 跟dissociative curve得到資訊
我只有做NTC,40個cycle的反應就是undetermined
早期有在TaqMan系統出現過38-39,
後來是看amplification curve決定是否有污染
但是覺得這樣太投機,所以後來就更小心
SYBR green系統下也只相信Ct of NTC=40的data
不知道這樣的回答能否解答你的疑惑?
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