Re: [問題] Real-time PCR

看板Biotech (生命科學)作者lakerjackt (NN )時間19年前 (2006/12/17 15:38)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : ※ 引述《lakerjackt (NN )》之銘言： : : 我的檢體有兩部分,一種病人,一種正常人,..起初是認為怕抽不太夠... : : 我現在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部轉,轉的總體積約100ul : : 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼錯..哈)的kit去抽,回溶100ul, : : 分三管去轉,每管加30ul的RNA,每館總體積都約100ul : : cDNA後來沒有稀釋5倍..但後來用正常人的cDNA有稀釋10倍和100倍 : : 但都做不出來 : : )cDNA,無論是稀釋10倍會100倍都只加1ul,反應的總體機是10ul : : 我目前還沒拿病人的cDNA來做...real-time : : 我猜可能RNA農度太高了,但我pcr還是做的出來阿!! : : 因為起出是怕說太稀了!! : : 不然就是你說的...primer要做的size超過200吧..導致不好做 : : 謝謝 : 不客氣,大家一起討論求進步嘍~~ : PCR需求比real-time PCR寬鬆很多, : 請不要以為"PCR做的出來就一定沒問題"比較好喔! : 雖然說你的RT是東湊西湊kit做出來的 : 我想你的RNA轉cDNA這一步非常的奇怪喔! 你有測過RNA得OD260/280嗎? : 一般都是用1-2ug去轉cDNA,反應最後體積是20ul : 然後再加DEPC-H2O到100ul(就是我所說的5倍稀釋.看來你跟我說的是一樣的) : 你這樣轉cDNA實在是太浪費RNA了啦! : 不管你加了多少,reverse transcriptase按照protocol來能轉的RNA就是1-2ug : 多加只是浪費 : 我的template也是病人的血球細胞,3ml的全血抽出來的RNA就可以讓我做好多次RT : 再加上你說的internal control Ct也在40左右 : (amplification curve一點都沒有上升的趨勢吧) : 我認為是你下的template太稀了(但是10倍應該也只差3點多個cycle,100倍應該是差7) : 然後再加上你的產物如果又大於200bp,你到底做多大呢?? : (不過,連b-actin都大於200 bp嗎?) : 大概就是它不容易做出來的原因了謝謝......我了解可能就是做的長度太長... 那我想問一下......cDNA不純有沒有可能抑制real-time的表現其實就是cDNA裡頭有剩餘的dNTP或可能會抑制的buffer...有辦法解決嘛?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.169.88.217 ※ 編輯: lakerjackt 來自: 218.169.88.217 (12/17 15:49)