Re: [問題] Real-time PCR

看板Biotech (生命科學)作者Phaeton (凰呀的鳴叫~)時間18年前 (2007/11/16 22:50)推噓0(0推 0噓 0→)

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嗯謝謝那位大大推那麼多文我了解那公式了我說的y=mx+b這個ｘ軸是ＤＮＡ量Ｙ軸是ＣＴ值當斜率Ｍ　＝　－３．２左右（剛查到　可是不知為什麼　＝　＝）會有最佳效率現在我還是不知為什麼會有這值＝　　＝請會大大的教我一下謝謝 ※ 引述《Phaeton (凰呀的鳴叫~)》之銘言： : 請問一下喔 : 因為想了解Q PCR : 所以爬文找知識 : 看到這篇裡面提到的重要公式 : 我在知識+和GOOGLE都找不太到 : 可以請哪位大大解釋一下 : Y是什麼?? : 而N應該等於多少？？ : ＣＴ值嗎？？ : 另外我可以用斜率的方式來看ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ嗎？？ : 就是用 Y = MX + B的方式來看　 : Ｍ應該要等於多少才會有最好的效率？？ : 謝謝 : ※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : : PCR有一個重要的公式 : : y=(1+e)^n e是PCR反應的效率,而n次方指的就是cycle number : : 就我所知real-time PCR,是希望每一個PCR反應能盡量達到 e=100% : : 所以才會限制產物大小 (<250 bp) 跟反應溫度(2-step PCR) : : 當然對於template的要求也是非常的高 : : 如果你的template quality不佳,做出來的結果常常會認你吐血 : : (我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差個1結果就差兩倍,真的會吐血 : : 觀察國外這方面做的好的實驗室,對於template的quality要求是嚴格到不行) : : 如果你都按照他的限制下去做,基本上他們是可以保證一定可以得到很好的結果 : : 但是溫度是絕對可以調整的 : : 如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR還好,當然沒有理由不調整溫度 : : (這又牽涉到primer的設計,所以他們也出了一套軟體專門幫你設計適合的primer) : : 只是你要確定這樣條件下的e比他們條件下的e來的好 : : 另外,反應體積也是要盡量精確,因為reagent裡還有ROX dye, : : 機器會在判讀時拿這個螢光作為不同well之間體積的校正 : : (但是怎麼校正我就不清楚了,有興趣者可以自行測試,再來跟大家分享嗎?) : : 不過一我的經驗,差個1-2 micro-liter是影響不了多少啦!(我做25 micro-liter的) : : RT Real-time我也做過,用的是TRIzol抽的 : : OD 260/280實在不怎麼好(說來慚愧,1.6我就歡天喜地了) : : 但是也都做的出來 : : 剛開始還傻傻的買他的one-step RT-PCR reagent(貴到爆) : : 後來也開是自己轉(我用過BD以及invitrogen的kit) : : 但是結果仍然滿意,所以抽RNA跟RT的kit應該是影響不大 : : 反而是你操作的好不好的問題 : : 另外你的反應做大於40 cycle,然後Ct只會在40以後出現 : : 我也如bloodgas大大會建議你看一下internal control的Ct會在多少出現? : : 可以一併確認是quality的問題或者你的基因表現就是低到不行 : : 希望對你有所幫助 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.228.177.81