Re: [問題] Real-time PCR
※ 引述《lakerjackt (NN )》之銘言：
: 有人用過從血液中抽出的cDNA做real-time PCR嗎?
: 因為本身是用ABI的機器run real-time PCR...
: 但一直try不好PCR的condition...
: 不然就是有出來後...再做一次就沒出來了...
: 且Ct值一值都滿後面的...40上下...
: 所以一直做到沒信心...><
: 所以我想請問各位real-time PCR幾個問題..以解笨小弟我的疑惑..
: 1.real-time PCR做的時候,反應的量一定要加的很精準嗎???
: 2.ABI的real-time PCR是不是都不用設定annealing..這樣一定都做的出來喔??
: 3.因為我是用kit抽RNA,但是是用一般方法轉cDNA..所以會有可能cDNA轉的不好嗎?
: 4.請問有人用invitrogen這家的kit抽RNA嗎?...做後續效果都可做很漂亮嗎??
: 5.請高手幫我想一下我該怎麼辦...謝謝...
1.是的,要盡可能精準
2.我們實驗室用的是Roche的機器,不過所有program的溫度跟時間都可以調整,因為每一個
基因都不一樣,同樣的條件不可能適用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI機器
沒用過,所謂的不能改條件意思是????
3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一樣,quality沒問題,reverse transcription只要沒有
RNase污染就沒問題
4.要check RNA quality就直接跑個gel來看,28S/18S的band正確,比例也正確就可以
5.crossing point 40是太低了,應該就是沒有東西吧...你測過抽出來的RNA的濃度嗎?
你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外,
你做過house keeping gene的real-time PCR嗎?這樣可以直接確定你的cDNA有沒有問題.
還有一點就是可以加上一個positive control,plasmid或是PCR fragment,這樣才能
確定至少real time PCR的過程沒有問題..
以上
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