[問題] fusion protein的純化

看板Biotech (生命科學)作者yffurdyeknom (Unhurried Justice)時間19年前 (2007/02/16 02:18)推噓1(1推 0噓 1→)

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如題請問板上有做過帶有6 his-tag fusion protein純化的大大在從column上elute蛋白的時候是用多少imidazole濃度的elute buffer去elute的? 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute 但似乎沒有elute出來而查純化的書上面寫在某些case中要用250 mMimidazole濃度的elute buffer去elute 因此想問問大家是否有用如此高濃度imidazole濃度的elute buffer去elute的經驗如上述所題小弟這次的純化沒有成功因此也考慮fusion protein存在於inclusion body中的可能性在lysate(BL 21)離心(11000rpm 30min 4度c)之後觀察到存於離心管管壁上的pellet非常難用水洗掉加普通的detergent也洗了半天才洗掉而以之前純化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的經驗(同樣都是100ml culture) 在lysate離心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不會難洗因此在此才推論fusion protein存於inclusion body中的可能性 p.s. 在此之前我有先進行一次1ml culture的test實驗結果我要的fusion protein的確是存在於supernatant之中在此也順便請問一下板上高手們什麼情況下會形成inclusion body? 我在一本純化的書中看到culture size會影響所以我推測這是fusion prtein從原本test顯示的supernatant中跑到inclusion body原因不知這樣是否正確? 而我也想請問大家這樣會形成inclusion body的原理是什麼? 還有也請問大家離菌或離lysate時的溫度會有造成inclusion body形成嗎(我都用4度c)? 又如果把經IPTG induce之後的菌液冰到4度c三個小時後再處理(lyse) 也會造成inclusion body形成嗎? 問了一堆問題希望有經驗的前輩們給我一些指示~~~ 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.58.30.209