Re: [問題] fusion protein的純化

看板Biotech (生命科學)作者bee (Bee)時間19年前 (2007/02/16 02:37)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《yffurdyeknom (Unhurried Justice)》之銘言： : 如題 : 請問板上有做過帶有6 his-tag fusion protein純化的大大 : 在從column上elute蛋白的時候 : 是用多少imidazole濃度的elute buffer去elute的? : 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute : 但似乎沒有elute出來 : 而查純化的書 : 上面寫在某些case中 : 要用250 mMimidazole濃度的elute buffer去elute : 因此想問問大家是否有用如此高濃度imidazole濃度的elute buffer去elute的經驗 175mM 如果洗不出來有幾種可能第一個他的結合力太強......這種可能性不大但不是沒有 His-tag 有一個特色其實妳用到100 mM imidazole 就會開始有些蛋白開始洗出ꠊ只是量很少第二個我曾經用到　500　mM imidazole 沒有問題第三妳的蛋白根本沒有結合到管柱上面去可能是過柱的條件不對或是妳的蛋白根本就沒出來過柱的時候把每一個fraction 都收一點一起跑膠確認妳要的東西跑到哪裡去 : 如上述所題 : 小弟這次的純化沒有成功 : 因此也考慮fusion protein存在於inclusion body中的可能性 : 在lysate(BL 21)離心(11000rpm 30min 4度c)之後 : 觀察到存於離心管管壁上的pellet非常難用水洗掉 : 加普通的detergent也洗了半天才洗掉 : 而以之前純化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的經驗(同樣都是100ml culture) : 在lysate離心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不會難洗 : 因此在此才推論fusion protein存於inclusion body中的可能性 : p.s. 在此之前我有先進行一次1ml culture的test實驗 : 結果我要的fusion protein的確是存在於supernatant之中 : 在此也順便請問一下板上高手們 : 什麼情況下會形成inclusion body? : 我在一本純化的書中看到culture size會影響 : 所以我推測這是fusion prtein從原本test顯示的supernatant中跑到inclusion body原因 : 不知這樣是否正確? 這是一種可能其實這一點很容易確定每次做大量培養誘導蛋白產生時除了大瓶收下來以外妳也可以同時收個小量先做確認當然會多花一點時間跟功夫但是至少不會做到後來甚麼蛋都沒有就算失敗也至少可以知道問題出在哪裡 : 而我也想請問大家這樣會形成inclusion body的原理是什麼? : 還有也請問大家這太複雜自己看一下書 : 離菌或離lysate時的溫度會有造成inclusion body形成嗎(我都用4度c)? 沒聽說過也不太可能 inclusion body 主要是培養條件造成的做成lysate 　時菌體已經打破他想形成恐怕還沒機會 : 又如果把經IPTG induce之後的菌液冰到4度c三個小時後再處理(lyse) : 也會造成inclusion body形成嗎?: 問了一堆問題同樣的答案如上主要是因為培養條件冷凍會讓細菌的生長減到很慢 : 希望有經驗的前輩們給我一些指示~~~ : 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 138.26.192.37