Re: [求救] real-time pcr的問題

看板Biotech (生命科學)作者AS1 (AS1)時間17年前 (2008/02/21 18:48)推噓10(10推 0噓 5→)

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這個問題再次重伸首先專員來兩次第二次待一整天結果有些還是沒出來單個SAMPLE有很多波峰那是不是每個PRIMER都有固定的波峰跑膠結果有些沒東西或者是其他雜BAND 說我們環境太雜但問題是跑RT-PCR就不會有這種狀況之後電話聯絡建議我們換抽RNA的KIT 之前是用傳統方式抽的(TRIZOL) 結果還是沒有預期產物有什麼理由是買機器的公司要負責試如果她們完完整整跑出來一次 DATE都很漂亮我會來這照做就好了做不出來是自己的問題 ※ 引述《leftt (left)》之銘言： : 原PO的問題應該是不懂realtimePCR : 而且是整個公司都不太懂 : 然後ROCHE的專員跟版眾一樣秀才遇到兵呵呵 : 如果搞不懂換AB, BioRad的realtime機器也是一樣 : 八連排的tube 出來的data也不會比較漂亮唷 : 而且AB的試劑也沒有便宜到哪裡去吧 : 幾個重點 : 1.realtimePCR本來就可以做診斷 : 就我所知疾管局就有用當年診斷SARS時也很風光 : 你可以帶隊殺去學的地方其實還不少 : 問題是一般人都只願意帶學習態度誠懇的人做實驗吧我們不需要那麼風光當首例這個我要問一下 SARS當初如果用RT-PCR做的出來嗎 : 2.RT-PCR跑膠有band所以你認為診斷正確不需要sequence就可以 : 但是你怎麼知道你哪個band是正確的放大標的物? : 也許是數個尺寸一樣但是內容不同的放大產物混合在一起勒 : realtimePCR可以利用melting curve偵測是否為單一純產物這個我不懂因為既然melting curve可以判斷是否為純產物那如果melting curve 就是一樣的產物嗎 : 3.毛細管的產物也可以抽出來跑電泳 : 如果你們實驗設計是正確的那這個電泳產物和RT-PCR的產物應該是要一致的 : 普通PCR的primer也可以試跑realtimePCR的 : 有時候你可以發現原來先前跑普通PCR的primer是大大的有問題 : 可能是產物不對也可能有嚴重的primer dimer DIMER的問題已經解決了現在同一SAMPLE 再試第三組PRIMER : 4.過了melting curve後整個螢光值掉下來 : 請先了解melting curve的定義以及用途 : 還有螢光染劑發光的原理及時機 : 5.分子生物學實驗本來就要求較純的原料 : 因為在放大檢測的狀況一點細微的誤差很容易就被無限放大而蓋住原有資料 : 普通 PCR也無法忍受亂七八糟的檢體吧只是他出錯的時候比較不容易被發現 : 相對而言 data也比較不可信賴 : 如果目標真的不好偵測也許不要用SyBr 換TaqMan probe看看 : 正確率也許高一點要花錢這個我不提 : 6.realtimePCR的確為快速診斷的工具 : 如果你了解早期診斷的工具就知道有些病毒培養確認動輒是兩週三週的時間 : 跑realtimePCR可以縮短到數小時即有結果 : 而ROCHE毛細管PCR由於是空氣加熱升降溫快速 cycle time較一般機器短 : 說快速也沒錯早期診斷通常有症狀才會要我們去所以用RT-PCR都做的出來初非是很奇怪的SAMPLE 所以有培養設備但不養 : 你們的問題是出在對實驗原理不了解 : 其實只要找一個學分生的有在作realtimePCR的 : 花個幾天時間大概就可以找出毛病在哪裡 : 對於會用的人來兩次了還是沒解決問題倒是建議我們換抽RNA的KIT : LightCycler其實挺好用的介面也比較親切 : 可是對於不懂也不願意去學的人 : 那只是一台一百多萬的小電鍋而已而且還會狂吃耗材錢唷 : ※ 引述《micocat (de novo)》之銘言： : : RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一樣的 : : 我們實驗室有遇過同樣的primer RT做的出來，real-time卻p不到的情形 : : 後來換了primer就解決了 : : 建議可以換組primer試試 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.123.116.192 ※ 編輯: AS1 來自: 122.123.116.192 (02/21 18:56) ※ 編輯: AS1 來自: 122.123.116.192 (02/21 19:03) ※ 編輯: AS1 來自: 122.123.116.192 (02/21 19:05) ※ 編輯: AS1 來自: 122.123.116.192 (02/21 19:06) ※ 編輯: AS1 來自: 122.123.116.192 (02/21 19:12)