Re: [求救] real-time pcr的問題

看板Biotech (生命科學)作者leftt (left)時間16年前 (2008/02/19 12:28)推噓9(9推 0噓 4→)

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原PO的問題應該是不懂realtimePCR 而且是整個公司都不太懂然後ROCHE的專員跟版眾一樣秀才遇到兵呵呵如果搞不懂換AB, BioRad的realtime機器也是一樣八連排的tube 出來的data也不會比較漂亮唷而且AB的試劑也沒有便宜到哪裡去吧幾個重點 1.realtimePCR本來就可以做診斷就我所知疾管局就有用當年診斷SARS時也很風光你可以帶隊殺去學的地方其實還不少問題是一般人都只願意帶學習態度誠懇的人做實驗吧 2.RT-PCR跑膠有band所以你認為診斷正確不需要sequence就可以但是你怎麼知道你哪個band是正確的放大標的物? 也許是數個尺寸一樣但是內容不同的放大產物混合在一起勒 realtimePCR可以利用melting curve偵測是否為單一純產物 3.毛細管的產物也可以抽出來跑電泳如果你們實驗設計是正確的那這個電泳產物和RT-PCR的產物應該是要一致的普通PCR的primer也可以試跑realtimePCR的有時候你可以發現原來先前跑普通PCR的primer是大大的有問題可能是產物不對也可能有嚴重的primer dimer 4.過了melting curve後整個螢光值掉下來請先了解melting curve的定義以及用途還有螢光染劑發光的原理及時機 5.分子生物學實驗本來就要求較純的原料因為在放大檢測的狀況一點細微的誤差很容易就被無限放大而蓋住原有資料普通 PCR也無法忍受亂七八糟的檢體吧只是他出錯的時候比較不容易被發現相對而言 data也比較不可信賴如果目標真的不好偵測也許不要用SyBr 換TaqMan probe看看正確率也許高一點 6.realtimePCR的確為快速診斷的工具如果你了解早期診斷的工具就知道有些病毒培養確認動輒是兩週三週的時間跑realtimePCR可以縮短到數小時即有結果而ROCHE毛細管PCR由於是空氣加熱升降溫快速 cycle time較一般機器短說快速也沒錯你們的問題是出在對實驗原理不了解其實只要找一個學分生的有在作realtimePCR的花個幾天時間大概就可以找出毛病在哪裡對於會用的人 LightCycler其實挺好用的介面也比較親切可是對於不懂也不願意去學的人那只是一台一百多萬的小電鍋而已而且還會狂吃耗材錢唷 ※ 引述《micocat (de novo)》之銘言： : : 前文已說做RT-PCR做的出來做REAL-TIME PCR 就算很純也未必出的來 : RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一樣的 : 我們實驗室有遇過同樣的primer RT做的出來，real-time卻p不到的情形 : 後來換了primer就解決了 : 建議可以換組primer試試 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.77.241.3