Re: [求救] 有關PCR的問題

看板Biotech (生命科學)作者polomi (polomi)時間10年前 (2015/02/12 09:40)推噓0(0推 0噓 2→)

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※ 引述《licat (licat)》之銘言： : 不好意思因為資訊太少，我想問一些問題便於判斷 : 　請問想去除的片段長度多大？去除的片段長度約為450 bp，而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。 : : 是對genomic DNA上的目標基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。 : 請問是甚麼抗生素基因？使用的互換機制是？利用kanamycin 15ug/ml，互換的機制是同源重組交換的方式。有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的， http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology 主要的參考是這篇paper http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 : 　（抗生素基因是帶在質體上？或著你送入的是線狀DNA？） : 然後你應該是使用在抗生素盤上長出來的菌落去抽DNA、做後續PCR吧？送入的抗性基因是線狀的DNA，主要設計是在取代用的抗kanamycin基因序列前後，各加上目標取代位置前後各50bp送入。主要送入方式都是以電穿孔的方式。　因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型，過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。 : : 是不是要再另外購買什麼或是連絡廠商才能打開機器的權限? : 　我覺得不像是PCR或抽DNA的問題， : 　因為你的control反應很專一，這種PCR你沾一點菌落或菌液直接當模板都做得出來 : 　 : 　所以你沒夾出來，我覺得比較可能是 : 　1. 那些長出來的菌落是污染的雜菌，沒有你primer可認得的序列 : 　　（如果你提供詳細實驗流程跟結果：那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過，用原本的primer表現，的確原本的片段長度約為1KB左右。應該可以初步排除雜菌的可能性。還未定序過，也有可能是其他的雜菌。 : 　　像是怎麼送入DNA？塗盤後生長菌落數？會比較好判斷）都是使用電穿孔的方式，恩我用附圖的方式可以嗎? http://ppt.cc/5iBm 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。　　 : 　2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互換掉了 : 　　（這得看primer座落位置跟整個互換的設計）阿~~~ 希望不要阿。我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ 　 : 　3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也沒錯， : 　　但PCR反應沒有強到可以夾出2 KB大小，所以你可以： : (1) 將annealing降到50，沒出來再降到45，再沒出來就放棄 : (2) 換別的廠牌的taq，直接測試50跟45度annealing : (3) 重新設計其他primer : 　　其實原先主要的annealing溫度為58度，現在有嘗試過， 50 55 58 60 62 64，主要都是30秒。也有嘗試著加入DMSO，其結果如下圖: http://ppt.cc/C99u : 　　我想你可以先測試上述的PCR條件， : 　　希望你annealing溫度一降就夾出來，問題解決~ : 祝實驗順利感謝您，我會先嘗試著降低溫度試試看～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.107.165.123 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1423705236.A.612.html