Re: [求救] 有關PCR的問題

看板Biotech (生命科學)作者polomi (polomi)時間10年前 (2015/02/11 09:37)推噓1(1推 0噓 7→)

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※ 引述《polomi (polomi)》之銘言： : 版上大家好~ : 小弟目前正在進行有關E. colo同源重組的實驗， : 最終的確認是使用PCR判斷有無成功的插入到genomic DNA上。 : 如果是失敗的會保留原長度約為1.1KB， : 成功的話會改變其長度。 : PCR都是使用相同的primer跟相同的溫度條件設定。 : 萃取完DNA後， : 也有使用DNA clean kit做純化的動作。 : 有測量OD260/280算濃度。 : 每管每次PCR添加的genomic DNA template都固定約為200~300ng。 : 使用的polymerase為 ACCU DNA polymerase。 : http://www.yeastern.com/Products.php?pid=169&pkid=10&pttype=60 : 按照原廠建議使用。 : primer最終濃度為0.2uM : dNTP 最終濃度為 0.1mM : 每次都固定50ul : 可是最近幾次的PCR都無法出現結果。 : 有使用先前成功的template做對照。 : 有附圖說明，請參考。 : http://ppt.cc/to8T : 均為同時跑PCR的結果。 : PCR buffer是先除去template跟polymerase外先混合均勻， : 再分別添加的。 : 各項溫度的設定並未改變。 : 請問我有哪裡需要再做改變的? : 麻煩各位了不好意思，可能小弟上次說的不夠清楚。因為目前正在做E. coli同源重組的實驗，是對genomic DNA上的目標基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。所以，如果取代失敗的話，用原本的primer去PCR的話，應該還是原本的片段長度。而如果取代成功，片段長度會有所改變。而預估如果成功的取代了原本的目標基因片段，會從原本的1KB多變成約2KB左右的長度。如果取代失敗的話， PCR的結果會直接呈現1KB的band出現，但是目前的結果PCR後完全沒有任何的band產生。小弟有做了比對的組別，如圖， http://ppt.cc/to8T 應該可以證明PCR的polymerase與primer沒有問題。是不是要對PCR的其他溫度條件與時間做改變。目前的PCR溫度設定條件如下: 第一步: 94度C， 5分鐘。第二步: 94度C， 30秒。 58度C， 30秒。 68度C， 2分30秒。第三步: 68度C， 7分鐘。結束。使用的PCR儀器為BIO-RAD My Cycler。請問，如果從原先的1點多KB片段長度變成2點多KB，是不是要修改那些PCR條件。已經有嘗試過將annealing 溫度從58調整為 60 62 64過。也有嘗試著將低到55。但似乎都還是只有比對用的有成功產生band出現。順帶請問一下，請問這台PCR如果要做梯度溫度的分段PCR，是不是要再另外購買什麼或是連絡廠商才能打開機器的權限? 感謝大家。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.107.165.123 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1423618677.A.EEF.html