Re: <求救>lipofectamine 效率

看板Biology (生物學)作者nidus (咕嘰)時間17年前 (2008/10/06 15:58)推噓2(2推 0噓 0→)

留言2則, 2人參與討論串2/2 (看更多)

※ 引述《nidus (咕嘰)》之銘言： : 標題: <求救>lipofectamine 效率 : 時間: Sun Oct 5 22:49:17 2008 : : 請問有人用過嗎？？ : : 我做了好幾次效率低到看不到想要表現的protein : : 我的步驟如下： : : genaid抽plasmid 再以酒精沈澱進一步純化 : : 使用細胞為hela : : transfect 前一天在六公分盤種9X10五次方細胞 : : 第二天取500λserum free DMEM 與 3μg plasmid混和 : : 20λlipofectamine與500λserum free DMEM混和等五分鐘 : : 將上述兩溶液混和等20分鐘 : : 將混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盤中 : : HeLa cell 六公分盤會先以PBS wash兩次以將serum洗掉 : : 六小時候再將medium置換成有serum的DMEM : : 24小時候收細胞 western檢測 : : ------------------------------------------------------------------- : : plasmid有提高至8μg 結果還是一樣 : : plasmid也有digest後跑膠位置也對 : : 只不過我欲表現的protein 並不是一個完整的protein : : 完整序列有276aa 而我只有取1~120 : : 請問有沒有可能是無法folding而被進一步degrate掉？？ : : : 以上希望有大大相助任何建議都好 : : 謝謝 : : -- : ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 125.225.133.107 : ※ nidus:轉錄至看板 Biotech 10/05 23:30 : 推 vixen:1.你怎麼抽plasmid的? 2.丟個GFP plasmid做控制組 10/06 12:39 : 推 abc0:lipofectamine+DMEM與plasmid+DMEM是怎樣混合的?請仔細說一下 10/06 12:44 : → nidus:全照genaid protocol抽 10/06 15:40 : → nidus:其實有做過只有EGFP的結果他有表現而且還蠻多的 10/06 15:40 3μg plasmid+500λ DMEM 置於eppendorf中因為我有六組plasmid所以其實是3250λ DMEM加 70 lipofectamine 等五分鐘後各取500λ加到還有plasmid的eppendorf中以上有混合的地方我都會搖晃均勻 ----------------------------------------------------------------------- 因為EGFP only 有表現出來所以本人懷疑EGFP fusion的protien flagment無法正常folding 而可能進一步降解只不過PAPER中常常可以看到overexpression protein deletion clone 而且我的實驗室歷屆學長姐也常常表現這一類的deletion protein 他們都可以表現出來所以我現在快要找不到原因是什麼了 T＿T -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.155