Re: 請問有沒有人做IP-->2D的??

看板Biotech (生命科學)作者timbrian (perk yourself up)時間19年前 (2006/04/28 01:55)推噓2(2推 0噓 0→)

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※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : : 可否請問什麼作法?.. : 就是DNA affinity precipitation assay(簡稱DAPA) : DAPA做完後先跑一維SDS-PAGE看看差異 : (loading時，連beads也給她load下去了) : : 看不大懂.. : : 可否請問到底是 IP 沒東西還是 IP 完跑 2D 後東西不見了? : 有東西，跑一維sds-page以銀染染色是可以看到蛋白質的 : : 目的是否是要釣 transcription factor ? : 是 : : 如果是要釣 transcription factor : : 為何會預期 PAGE 上看的到明顯的 band? : 為什麼不會?當然會看到蛋白質不是嗎? o.O 有點不懂這裡的意思哩~ : 應該是說wild type probe跟mutant probe比 : 有差異的點就是我要的蛋白質感謝.. 由於之前說跑普通 PAGE 對我來說跳太快了有點看不大懂 transcription factor 量隨著蛋白質的不同而有差不過一般來說都算是少量的蛋白質所以我不確定到底是本身量就太少還是後續的問題 so bead 抓蛋白質這方面沒有問題與蛋白質量上沒有問題 : : bead 上到底蛋白質多不多? (是沒 elute 下來還是根本極少蛋白質bind 在 bead上?) : : (何不取一點 bead 直接跑 PAGE ?) : : 且 IP 完跑 2D 的目的為何 ? : 很多，我已經跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了 : 雖說有差異但還是分不太開 so 問題是rehydration buffer 無法將 target protein 自 bead 中 elute 下來了 try this protocol (查到的 ..只能嘗試看看) ref : http://www.bioclon.com/magnetic-streptavidin-beads.pdf 節錄自以上網站的 Protein or antibody To elute the bound biotinylated protein or antibody from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add the appropriate amount of Elution Buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.5), incubate for 0.5-5 min at room temperature, collect the magnetic beads by the magnetic separator and transfer the supernatant to a fresh tube.Immediately neutralize the supernatant to pH 7.0 by adding 1/10 volume of Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0) DNA Long nucleic acids used as biotinylated probes are not recommended due to difficulty in elution. For short biotinylated oligos, user can try the following method: 1. To elute the bound biotinylated oligo from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add appropriate amount of ElutionBuffer (10 mM EDTA, pH 8.2, 95% formamide), incubate at 65C for 2 min. 2. Collect the magnetic beads by the magnetic separator andtransfer the supernatant to a fresh tube 但你的系統又略有所不同可能要在修飾一下.. : 為什麼用2D? 因為2D一來我自己會，第二可以分的比較開 : (本來還想2D可以loading比較多的體積蛋白質多，差異應該也多) : beads我剛說了，有跑而且有蛋白質~~~ : 再不行我看我先從1D著手好了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.68.73.212