Re: [問題] 新手問 Real Time-PCR ~

看板Biotech (生命科學)作者mikoyan (mikoyan)時間19年前 (2006/07/30 18:39)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《huangsw (Orz)》之銘言： : ※ 引述《mikoyan (mikoyan)》之銘言ꄊ: 1. : 30-40 cycle才過Ct : 代表你的sample 是low copy number : 簡單的說 target DNA濃度不高 : 所以primer 沒有很快的進行PCR cycle 大量複製出DNA : 想要快速達到Ct值可以試著增加DNA濃度 : 舉例來說 mtDNA為檢體時 : 螢光訊號很快就可以超越Ct... : 因為mtDNA有母系遺傳以及HIGH copy number的特性 : 2. : 我知道的SYBR... 裡面沒有Quencher dye耶... : 會用到Quencher-Repoter dye probe的是 Taqman SNP assay 我們用的是 Master Mix (我在 ABI 的網站上沒有看到這一項商品) 助教解釋裡面有 SYBR I Green, buffer, Taq, nucleic acid 我對照助教提供的成分和 ABI 公佈的商品細項我覺得 Master Mix 比較像是 ABI 上賣的 TaqMAN kit.. o.Oa 我個人猜想應該是有使用 Quencher-Reporter Dye Probes 只是助教沒有詳細說明使用材料不然這就和我先前所讀的原理不一樣了呵呵～ : 我知道 Ct 界線下會有螢光沒錯... : 但是那只是因為前十幾次PCR產生短片段雙股DNA所出現的螢光訊號 : 要到十幾個Cycle後(前面先複製了一堆template) : 每次PCR產物皆以 log 方式增加 : 螢光才會跟著上升越過Ct..... : 當你的DNA濃度低所含的Target DNA也比較少 : 所以需要比較多的Cycle才可以讓複製呈現 log 方式上升那些 Ct 以下的訊號有些會成為以 Log 倍數成長代表性訊號我想這些訊號是我們要的.... 而那些不會有 Ct, 不有後續 Log 成長的訊號呢 ? 我感覺這樣的訊號挺多的耶.... 這些訊號是不是反應中產生過多的 templates 而其中只有幾個 templates 才會接續 replication, 才有機會可以 Log 成長而那些沒被選中的, 就是那些雜訊呢 ? : 我在1.已經有說建議的方法當然不只那個方法啦...... : 以上是我對Real-time的了解.... 我實習的設備也是 ABI 7900HT ~ 這是我第一次做的 Real-Tiem PCR ! 多謝您的指導......... Orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.169.102.42