Re: [問題] 新手問 Real Time-PCR ~

看板Biotech (生命科學)作者huangsw (Orz)時間19年前 (2006/07/30 14:47)推噓0(0推 0噓 0→)

留言0則, 0人參與討論串2/4 (看更多)

※ 引述《mikoyan (mikoyan)》之銘言： : 各位學長姊, : 剛剛上課學習如何分析 Real Time-PCR 的圖, 產生了不少疑惑..... : 請各位學長姊協助我釐清一些觀念～ : 簡單介紹我們練習的材料: : Nanog gene, Forward & Reverse Primers, TaqMAN, SYBR I. : 以下是我的疑惑... : 1. 為什麼要到了 30 ~ 40 cycles 才會出現 ct 值 ? : 而不是一開始前幾個 cycle 就有 ct 值的出現 ? : 2. 30th cycle 前, threshold line 以下就已經有螢光訊號了, : 為什麼這些不是有效的 PCR 訊號 ? : 而要等到 30~40th cycle 以後才會出現具有代表性的訊號 ? : 我個人的想法是: : 這些不具代表性的訊號可能來自於 primer dimers 和 quencher-reporter dye probes : 之間作用所產生的訊號.... : 以上是我對第二個疑惑的想法, 第一個.... 我還在釐清中......... >"<~ 1. 30-40 cycle才過Ct 代表你的sample 是low copy number 簡單的說 target DNA濃度不高所以primer 沒有很快的進行PCR cycle 大量複製出DNA 想要快速達到Ct值可以試著增加DNA濃度舉例來說 mtDNA為檢體時螢光訊號很快就可以超越Ct... 因為mtDNA有母系遺傳以及HIGH copy number的特性 2. 我知道的SYBR... 裡面沒有Quencher dye耶... 會用到Quencher-Repoter dye probe的是 Taqman SNP assay 我知道 Ct 界線下會有螢光沒錯... 但是那只是因為前十幾次PCR產生短片段雙股DNA所出現的螢光訊號要到十幾個Cycle後(前面先複製了一堆template) 每次PCR產物皆以 log 方式增加螢光才會跟著上升越過Ct..... 當你的DNA濃度低所含的Target DNA也比較少所以需要比較多的Cycle才可以讓複製呈現 log 方式上升我在1.已經有說建議的方法當然不只那個方法啦...... 以上是我對Real-time的了解.... -- 我家是買ABI 7900HT 不知道您的設備是? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.201.40.216 ※ 編輯: huangsw 來自: 210.201.40.216 (07/30 18:04)