Re: [問題] western blotting
※ 引述《paua (waiting for good news)》之銘言：
: 我也有做P-Akt，但sample與你不同。
: 我說說我的步驟:
: 1. fresh cell lysate (收sample之後，馬上定量、跑膠)
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
這步驟很重要,要看磷酸化蛋白
lysate一收下來就要快跑wetern了
不管有沒有加phosphotase inhibitor
一進-80冰箱保存的話就都會degrade掉了~
: 2. 蛋白質定量後，40-50 ug/lane (小片膠)
: 3. transfer (semi dry) 15V (30-45min/1 mini gel, 45-60min/2 mini gels)
: 4. blocking buffer: 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: 5. 1Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 4 degree overnight
: 6. wash three times by TBST, 10 min each
: 7. 2Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: 8. same as step 6
: 9. ECL 1 min
: 10.壓片5-15分鐘可見結果
: 以上* 註記與你實驗中不同之處
: p.s. 我的milk的比例很隨意，範圍在3-5%
: ※ 編輯: paua 來自: 140.129.61.120 (09/23 02:14)
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