Re: [問題] western blotting
我雖然沒有做過P-AKT
不過我也曾經被搞的很慘
我那時候是做PP38
所以提供你一些方向
A>先確認sample有無問題
可以以actin測試現有的membrane來確認
B>上述OK的話
其實可以調一下1Ab，2Ab的條件例如溫度時間濃度
雖然說明書有他的條件
可是SAMPLE來源不同其實還是要微調一下條件才能壓出好片
若有任何問題歡迎大大指教
※ 引述《tkmax (給妳超強運~ :D)》之銘言：
: ※ 引述《paua (waiting for good news)》之銘言：
: : 我也有做P-Akt，但sample與你不同。
: : 我說說我的步驟:
: : 1. fresh cell lysate (收sample之後，馬上定量、跑膠)
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 這步驟很重要,要看磷酸化蛋白
: lysate一收下來就要快跑wetern了
: 不管有沒有加phosphotase inhibitor
: 一進-80冰箱保存的話就都會degrade掉了~
: : 2. 蛋白質定量後，40-50 ug/lane (小片膠)
: : 3. transfer (semi dry) 15V (30-45min/1 mini gel, 45-60min/2 mini gels)
: : 4. blocking buffer: 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: : 5. 1Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 4 degree overnight
: : 6. wash three times by TBST, 10 min each
: : 7. 2Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: : 8. same as step 6
: : 9. ECL 1 min
: : 10.壓片5-15分鐘可見結果
: : 以上* 註記與你實驗中不同之處
: : p.s. 我的milk的比例很隨意，範圍在3-5%
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