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[問題] cloning & TA cloning

看板Biotech (生命科學)作者 (人工智慧)時間19年前 (2006/11/15 23:08), 編輯推噓9(9推 0噓 6→)
留言15則, 4人參與, 最新討論串1/4 (看更多)
版上的高手大家好 有問題想請教大家 我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k) 質體是pGEX-2TK(4.9k) 這陣子做cloning試了好幾次 (兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後 用gel extraction分別純化後在ligation 16hr) 最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體 因此想改用TA cloning先接上去之後再切 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有 (分別是SmaI&EcoRI) 跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響 還有一點請教大家 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口 GGATCCCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI) CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到) (不知道畫這樣看不看的懂) 是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口 所以後續ligation失敗 謝謝大家 順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢? 問題有點多 真不好意思 再次感謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.123.127.44 ※ 編輯: Katoh 來自: 140.123.127.44 (11/15 23:53)
推
11/15 23:57, , 1F
兩個切位太近要分兩次切，smaI本來就不好切了兩個切位太近
11/15 23:57, 1F
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11/15 23:59, , 2F
又更難切了，話說回來smaI和EcoRI作用溫度不是不同嗎?
11/15 23:59, 2F
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11/16 00:00, , 3F
你怎麼一起切的哩
11/16 00:00, 3F
推
11/16 00:08, , 4F
我是分兩次切的沒錯 兩種RE各切4hr 沒說清楚真是不好意思
11/16 00:08, 4F
推
11/16 00:26, , 5F
cleavaged plasmid有加CIP處理過嗎
11/16 00:26, 5F
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11/16 00:28, , 6F
我是很想建議你不要用smaI啦......orz..
11/16 00:28, 6F
推
11/16 00:29, , 7F
因為2TK的MCS只有BamHI&EcoRI&SmaI 然後insert中間有BamHI囧
11/16 00:29, 7F
推
11/16 00:47, , 8F
乾洗這個原因？ http://myurl.com.tw/no7i
11/16 00:47, 8F
推
11/16 01:02, , 9F
我是先SmaI失活後再EcoRI 所以切質體應該不會有樓上的問題
11/16 01:02, 9F
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11/16 01:04, , 10F
insert的primer的話SmaI切口外我有多三個base EcoRI多兩個
11/16 01:04, 10F
推
11/16 01:09, , 11F
primer多了base還可能切不乾淨所以我才想改試TA cloning :(
11/16 01:09, 11F
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11/16 01:11, , 12F
我cleavaged plasmid沒有加CIP orz所以我應該先用原本的方法
11/16 01:11, 12F
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11/16 01:12, , 13F
做insert然後質體加CIP先試試看嗎?
11/16 01:12, 13F
推
11/16 11:55, , 14F
SmaI很好用阿.. @_@
11/16 11:55, 14F
推
11/16 13:25, , 15F
是地~
11/16 13:25, 15F
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