Re: [問題] cloning & TA cloning

看板Biotech (生命科學)作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)時間19年前 (2006/11/17 22:16)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之銘言： : ※ 引述《Katoh (人工智慧)》之銘言： : : 版上的高手大家好有問題想請教大家 : : 我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k) : : 質體是pGEX-2TK(4.9k) : : 這陣子做cloning試了好幾次 : : (兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後 : : 用gel extraction分別純化後在ligation 16hr) : : 最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體 : 2.8k確實不好接....我上一個用了2個多月....很慘 : 我後來也是先進TA vector 再去切plasmid eluted...才成功的 : : 因此想改用TA cloning先接上去之後再切 : : 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有 : : (分別是SmaI&EcoRI) : : 跟vector上的切口還蠻接近的不知道這樣會不會有影響 : : 還有一點請教大家 : : 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口 : : GGATCCCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI) : : CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到) : : (不知道畫這樣看不看的懂) : : 是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口 : : 所以後續ligation失敗 : 你的考量是正確的 : 我幫你查了一下EcoRI沒問題.....但SmaI 如果左右兩個Base切兩小時的效率是10% : 建議你先切SmaI heat inactivated後再切EcoRI啦 : : 謝謝大家 : : 順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢? : : 問題有點多真不好意思再次感謝! 個人推薦invitrogene Topo啦.....不過貴一點 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.58.54.177