Re: [問題] cloning & TA cloning
看板Biotech (生命科學)作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)時間19年前 (2006/11/17 22:04)推噓0(0推 0噓 0→)留言0則, 0人參與討論串2/4 (看更多)
※ 引述《Katoh (人工智慧)》之銘言：
: 版上的高手大家好 有問題想請教大家
: 我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k)
: 質體是pGEX-2TK(4.9k)
: 這陣子做cloning試了好幾次
: (兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後
: 用gel extraction分別純化後在ligation 16hr)
: 最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體
2.8k確實不好接....我上一個用了2個多月....很慘
我後來也是先進TA vector 再去切plasmid eluted...才成功的
: 因此想改用TA cloning先接上去之後再切
: 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
: (分別是SmaI&EcoRI)
: 跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響
: 還有一點請教大家
: 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口
: GGATCCCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI)
: CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到)
: (不知道畫這樣看不看的懂)
: 是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口
: 所以後續ligation失敗
你的考量是正確的
我幫你查了一下EcoRI沒問題.....但SmaI 如果左右 兩個Base切兩小時的效率是10%
建議你先切SmaI heat inactivated後再切EcoRI啦
: 謝謝大家
: 順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢?
: 問題有點多 真不好意思 再次感謝!
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