Re: [問題] cloning & TA cloning
※ 引述《Katoh (人工智慧)》之銘言：
: 版上的高手大家好 有問題想請教大家
: 我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k)
: 質體是pGEX-2TK(4.9k)
: 這陣子做cloning試了好幾次
: (兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後
: 用gel extraction分別純化後在ligation 16hr)
: 最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體
: 因此想改用TA cloning先接上去之後再切
: 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
: (分別是SmaI&EcoRI)
: 跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響
: 還有一點請教大家
: 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口
: GGATCCCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI)
: CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到)
: (不知道畫這樣看不看的懂)
: 是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口
: 所以後續ligation失敗
: 謝謝大家
: 順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢?
: 問題有點多 真不好意思 再次感謝!
兩個RE site重疊...應該是不容易切成功的..因為RE除了本身辨認的site之外,
還需要旁邊幾個延伸的bases當墊腳的...如果我從NEB的書上看圖說故事所得到
的資訊沒錯的話.
要不要重新設計一端的primer呢? 找不要靠那麼近的RE site...如果vector上
有的話啦...這樣子多花一點錢, 但比較確定能做得出來.
祝 實驗順利. 感恩.
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