Re: [求救] 抽pasmid的量都好少

看板Biotech (生命科學)作者puec時間19年前 (2006/12/15 17:38)推噓2(2推 0噓 0→)

留言2則, 2人參與討論串5/16 (看更多)

※ 引述《shuo218 (快樂的理由)》之銘言： : 最近在抽plasmid 因為我們實驗室是第一次接觸細菌的實驗 : 雖然照protocol下去做可是抽完的濃度都少的可以 : 下面是我的protocol 還麻煩大家可以幫我解決這個問題 : 1 colony of successfully pGL-transformed E.Coli to 10ml prewarmed LB+ (in tube) : Incubate o/n (16H) 37°C 60rpm : 一次培養2管，然後將兩管倒在一起成20ml : Centrifuge the 20ml culture at 10,000g x 5min : 接下來的步驟都是照promega的protocol做的 : 不過最後我們是用40ul回溶因為上次用100ul覺得量太少 : 結果今天做出來量更少大概只有0.0125 ug/ul : 實在不知道是哪邊出問題 : 因為後面要切然後ligase 回收再送到E.coli : 可是前面的量就很少後面好像根本就沒辦法做下去 : 大家有什麼好的方法嗎?謝謝!! 恩，妳的菌養太老了。解決的方法有兩個 1: 增加抗生素的濃度，(100ug/ml for ampicillin or 25 ug/ml for Kanamycin) 2. 縮短養菌的時間。妳可能會問，妳是照protocol養16小時，為什麼會太老。有幾個可能性 a. 妳的抗生素加太少。抗生素濃度越高，只要是在菌可以忍受的範圍內， plasmid的品質就會越好。 b. 每隻菌在不同的medium裡面生長速度不依樣，同一種medium用不同牌子的藥品配出來的效果也不一樣。同一個牌子的藥品，用不同的水去配，結果也會不一樣。 c. 妳的colony可能很大顆。有可能是菌真的長很好，也有可能妳偷懶回家前才挑colony，然後想說隔天下午來抽plasmid就好。反正要放16小時嘛。前一天晚上在實驗室混到11點挑colony第二天可以混到下午3點才開始做實驗。想想看，2mm的colony裡面的菌比1mm的colony多多少？答案是4倍！如果1mm的colony養16小時是剛剛好，那妳是人家的四倍，那妳養了16小時妳的菌量就是人家的4倍。妳不覺得很可怕嗎？如果妳要問"為什麼養太老的菌plasmid會變很少"。因為medium裡面的抗生素的量有限，當妳養過頭以後，medium裡面的抗生素都已經被分解光了，這時候一些沒有帶plasmid或是plasmid量很少的菌就會出頭天。因為他們不需要再花時間去複製妳的plasmid，所以會長得比有帶plasmid的菌還要快，到了最後， medium裡面大部分就都是沒有plasmid的菌了，所以自然你就抽不到plasmid了。希望這可以解決妳的問題。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.130.218.41