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[求救] WB internal control 定量問題

看板Biotech (生命科學)作者 (小軒)時間7年前 (2017/03/06 13:50), 編輯推噓8(8推 0噓 36→)
留言44則, 8人參與, 最新討論串1/6 (看更多)
其實是我們家另一個助理到別人家去學回來的protocol， 但是在一開始定量的部份讓我想破頭都不確定邏輯通不通... 希望能有高手幫忙解惑，謝謝~ 我們家跑WB前會先把sample用分光光度儀，595 nm測吸光值後， 算好個別濃度，再決定每個well要loading的量。 別人家是不測吸光值， 第一次都先直接loading一樣多的sample，然後直接跑internal control (tubulin)， 跑出來的結果去反算sample應該要loading的量， 所以第二次可能每個well sample量都不一樣，但internal control是一樣的。 雖然乍看之下好像沒甚麼大不了，但是總覺得...不夠嚴謹? 對方的解釋是說，他們覺得以internal control為標準就可以了， 但如果sample個別本身的internal control就有差異了呢? 還是這已經是可以通用的規則，internal control就能當標準化使用? 如果已經是通用標準的話我想就接受了，不然還是回來遵循老方法吧... 希望有人可以跟我討論，謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.233.2.209 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1488779404.A.85D.html
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03/06 13:52, , 1F
internal control會有變化的話就不能這當internal control
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推
03/06 14:22, , 2F
先說你的材料來料是啥? 那你用595nm測的原因是?
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推
03/06 14:36, , 3F
推a大的 internal control不應該有差異
03/06 14:36, 3F
推
03/06 16:43, , 4F
第一次聽到有人這樣算, 不覺得很浪費時間嗎, 要跑兩次膠ㄟ
03/06 16:43, 4F
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03/06 18:05, , 5F
你有找到一篇paper是這樣寫就知道可不可以啦~
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推
03/06 18:19, , 6F
不管怎樣在正常情況下你的Data的 internal control
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03/06 18:20, , 7F
都要一樣啊 所以理論上不管是用哪個方法最後結果都一樣
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03/06 18:20, , 8F
只是你定量可以訂的準的話就不用多跑一次啦
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推
03/06 18:23, , 9F
只是不太懂你測595nm是? protein assay的結果嗎?
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03/06 18:35, , 10F
595是bradford吧
03/06 18:35, 10F
推
03/06 18:40, , 11F
internal control不是本來就該當作standardisation?
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03/06 18:41, , 12F
不然你在paper裡看到每個lane的actin一樣粗是怎麼做
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的?
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03/06 18:47, , 14F
actin一樣粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-試跑膠
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或者複製貼上(誤)；一般都是採前定量,而不是原po的後定量
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推
03/06 20:55, , 16F
好奇原po說的這種方法 第二次跑出來的internal control真
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03/06 20:55, , 17F
的會一樣嗎?
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03/06 21:05, , 18F
就試跑當作前定量囉 應該真的會一樣粗吧
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03/06 21:26, , 19F
有聽過 前助理他碩班的實驗室是這樣"定量"的 (雖然我覺得有
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03/06 21:27, , 20F
點...作假的感覺...我個人感覺啦
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怎麼會 都是在算target protein跟standard的相對量啊
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qPCR不是也這樣算
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定"蛋白"跟定"圖片"的差異 呈現的結果可能一樣但定義不同
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但是圖片反映的是蛋白的量阿!哪有不同?
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那照你的說法qPCR不就定螢光強度和定RNA量的差異?
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03/07 03:22, , 26F
r是覺得一定要某個機器給你一個數字才是準的嗎XD 你去
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看看bradford的manual給的範例bsa跟lysozyme的濃度/吸
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光值比差多少
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我就說我個人"感覺"了啦
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因為有遇過藥是會影響tubulin的 當然就必須用別的internal
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control了 但如果在一開始不知道的情況下直接以此方法定量
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的話會有miss 當然也可以一開始第一次就把所有能當internal
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03/07 13:00, , 33F
control的蛋白都壓一遍啦~~~~(攤手)
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03/07 13:05, , 34F
回I大 圖片出來不是也有一個值嗎XDDDDDDD
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03/07 13:10, , 35F
總不會是用眼睛看吧 不然定出來後如果不同要怎麼調整??XD
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03/07 13:12, , 36F
總要有依據吧XDD
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03/07 13:29, , 37F
回a大 是呀 是以螢光強度代表RNA量 不是嗎??(抓頭)
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03/07 20:18, , 38F
所以在使用的internal control沒問題的狀況下
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圖片就代表蛋白量啦
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推
03/08 16:04, , 40F
Western Blot Normalization:
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03/08 16:04, , 41F
Challenges and Considerations for Quantitative Analysi
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03/08 16:04, , 42F
s
03/08 16:04, 42F
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03/08 16:04, , 43F
有空可以找一下這篇 有原po你說的標準方法 還有Normalizat
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03/08 16:04, , 44F
ion的方法 可能可以幫助你
03/08 16:04, 44F
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