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Re: [求救] WB internal control 定量問題

看板Biotech (生命科學)作者 (小軒)時間7年前 (2017/03/06 23:09), 7年前編輯推噓6(6推 0噓 22→)
留言28則, 4人參與, 最新討論串3/6 (看更多)
前文刪光光 --
→
03/06 13:52,
internal control會有變化的話就不能這當internal control
03/06 13:52
推
03/06 14:22,
先說你的材料來料是啥? 那你用595nm測的原因是?
03/06 14:22
推
03/06 14:36,
推a大的 internal control不應該有差異
03/06 14:36
我的材料來源是大鼠的脊髓，做的是有關神經損傷的部分， 因為在取sample的時候，每隻不可能取到一樣重的脊髓， 所以如下blence所說，之前學的都是前定量，用595 nm波長去測OD值，推算回蛋白濃度。 我知道理論上internal control是要夠準才能當internal control， 但是我從一開始的sample量就不會一致了， 所以...後定量也是可行的? 推 qiet: 第一次聽到有人這樣算, 不覺得很浪費時間嗎, 要跑兩次膠ㄟ 03/06 16:43
→
03/06 18:05,
你有找到一篇paper是這樣寫就知道可不可以啦~
03/06 18:05
paper好像都不會寫到如此詳細的步驟...
推
03/06 18:19,
不管怎樣在正常情況下你的Data的 internal control
03/06 18:19
→
03/06 18:20,
都要一樣啊 所以理論上不管是用哪個方法最後結果都一樣
03/06 18:20
→
03/06 18:20,
只是你定量可以訂的準的話就不用多跑一次啦
03/06 18:20
推
03/06 18:23,
只是不太懂你測595nm是? protein assay的結果嗎?
03/06 18:23
→
03/06 18:35,
595是bradford吧
03/06 18:35
推
03/06 18:40,
internal control不是本來就該當作standardisation?
03/06 18:40
→
03/06 18:41,
不然你在paper裡看到每個lane的actin一樣粗是怎麼做
03/06 18:41
→
03/06 18:41,
的?
03/06 18:41
→
03/06 18:47,
actin一樣粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-試跑膠
03/06 18:47
→
03/06 18:47,
或者複製貼上(誤)；一般都是採前定量,而不是原po的後定量
03/06 18:47
所以這兩種的確都是通行的定量方法?
推
03/06 20:55,
好奇原po說的這種方法 第二次跑出來的internal control真
03/06 20:55
→
03/06 20:55,
的會一樣嗎?
03/06 20:55
目前看來是差不多的。
→
03/06 21:05,
就試跑當作前定量囉 應該真的會一樣粗吧
03/06 21:05
→
03/06 21:26,
有聽過 前助理他碩班的實驗室是這樣"定量"的 (雖然我覺得有
03/06 21:26
→
03/06 21:27,
點...作假的感覺...我個人感覺啦
03/06 21:27
→
03/06 21:36,
怎麼會 都是在算target protein跟standard的相對量啊
03/06 21:36
→
03/06 21:36,
qPCR不是也這樣算
03/06 21:36
→
03/06 21:51,
定"蛋白"跟定"圖片"的差異 呈現的結果可能一樣但定義不同
03/06 21:51
我就是不確定如此，因為雖然結果可能一樣，但定義不同。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 59.126.51.113 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1488812968.A.9E3.html ※ 編輯: yvette26 (59.126.51.113), 03/06/2017 23:11:21
→
03/06 23:23, , 1F
internal control就是會跟著你的組織量多就多少就少
03/06 23:23, 1F
→
03/06 23:23, , 2F
才叫做internal control啊!
03/06 23:23, 2F
推
03/06 23:29, , 3F
舉個例子semi-qPCR 不就是跑膠根據 internal control
03/06 23:29, 3F
→
03/06 23:29, , 4F
band的強弱進行調整嗎?
03/06 23:29, 4F
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03/06 23:31, , 5F
照你的說法，以前paper上用semi-q的都有問題囉?
03/06 23:31, 5F
不好意思...我沒有做過semi-qPCR...所以這段例子我真的看不懂...
推
03/06 23:49, , 6F
我覺得問題在所選的internal control是不是真的不會隨著
03/06 23:49, 6F
→
03/06 23:49, , 7F
實驗條件變化
03/06 23:49, 7F
→
03/06 23:51, , 8F
沒錯!! 能這樣做的前提就是在這邊
03/06 23:51, 8F
推
03/06 23:52, , 9F
我們就有實驗同一個sample同時壓GAPDH和tubulin結果卻不一
03/06 23:52, 9F
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03/06 23:52, , 10F
樣，所以使用後定量的前提我覺得是要先能證明使用的intern
03/06 23:52, 10F
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03/06 23:52, , 11F
al control真的不會隨實驗變因而變化
03/06 23:52, 11F
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03/06 23:53, , 12F
但是這樣很辛苦就是，學弟妹被我要求一個sample要跑三種in
03/06 23:53, 12F
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03/06 23:53, , 13F
ternal control哈哈哈
03/06 23:53, 13F
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03/06 23:54, , 14F
這算是很嚴謹的做法啦XD
03/06 23:54, 14F
推
03/07 00:53, , 15F
所以你先定量完下去跑的結果internal control到底一不一
03/07 00:53, 15F
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03/07 00:53, , 16F
樣啊?
03/07 00:53, 16F
啊，我忘記補充了， 這兩種方法操作下，跑出來的internal control都是差不多的。 ※ 編輯: yvette26 (59.126.51.113), 03/07/2017 03:00:16
→
03/07 09:09, , 17F
semi-q 簡單來說就是cDNA pcr完之後跑膠,根據internal con
03/07 09:09, 17F
→
03/07 09:09, , 18F
trol的強弱來調整pcr cycle數，將大家internal control調
03/07 09:09, 18F
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03/07 09:09, , 19F
成一樣強來比較target gene表現量的多寡
03/07 09:09, 19F
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03/07 13:13, , 20F
感謝a90648~
03/07 13:13, 20F
推
03/07 23:43, , 21F
那如果這樣我認為用你原本的方法就好 沒必要多跑一片膠
03/07 23:43, 21F
→
03/07 23:44, , 22F
但是就如同其他版友討論第二種方法也沒甚麼不對
03/07 23:44, 22F
推
03/07 23:48, , 23F
有些時候某些樣品會遇到定量定不準的狀況..
03/07 23:48, 23F
→
03/07 23:48, , 24F
就可能可以考慮用第二種方式
03/07 23:48, 24F
→
03/09 00:10, , 25F
基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法
03/09 00:10, 25F
→
03/09 00:11, , 26F
得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題
03/09 00:11, 26F
→
03/09 00:11, , 27F
就讓大家自己做判斷了
03/09 00:11, 27F
→
03/09 00:12, , 28F
= = 推錯篇...
03/09 00:12, 28F
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