Re: [求救] WB internal control 定量問題

看板Biotech (生命科學)作者Ianthegood (厭惹故)時間7年前 (2017/03/07 18:43)推噓2(2推 0噓 9→)

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恕小弟不甚同意，一些觀點供大家參考 ※ 引述《tz2733 (這就是人蔘呀~)》之銘言： : 跟老闆討論了一下這種方法是否可行 : 老闆說不行... : 試著分享提到的幾個觀點 : 1.WB經過一抗二抗呈色出來的不是線性放大 : 所以此法不可行 : (此外我個人的經驗是單單是曝光時間不同兩個band之間的倍數差異就會不同可能1:2 : 變成1:1.8之類) 首先這裡我想問的是，貴老闆不同意的是「以western的band粗度量化來做線性normalisation」還是「以單一/數個protein的western band來做normalisation的概念」? 因為前者是技術問題, 我們已經積年累月的用western的band來做相對定量, 就算不準, 整體的趨勢也是看得到的(up/down regulation), 雖不中亦不遠矣. 如果要線性的話現在有很多CCD的機器開始可以做到,typhoon, LiCor等如果是後者的話那我也不懂了, 如果這樣的normalisation沒有credibility, 那以loading量normalise 壓完western後又何必再壓actin/GAPDH? : 2.蛋白質濃度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸這生化有教)來標準化sample : internal control則是一種蛋白質當然是前者比較能正確標準化sample : (我表達的詞可能不是很正確但希望提出來大家想一想) 我舉幾個極端的例子, 小弟現在在做的model最大表現量的蛋白只有一個aromatic AA 意思是這個蛋白如果暴增5倍我測280基本上測不到這個蛋白的變化量. 你說其他方式會比較準確嗎? bradford吃蛋白pI吃很兇, 你看原廠manual的範例 BSA跟lysozyme兩條standard curve斜率差多少, 而且也不是線性 BCA稍微好一點但是對buffer condition的要求甚高, 你裡面有點其他東西他就會給你加一堆吸光值上去我想要表達的是, 沒有一個(至少現在)protein assay是真正準確的, 除非你家裡有一台常常保養的maldi. 我們家很龜毛的博後真的要定量還會一個sample 用三種方式定過XD : 3.會出現這種方法可能是因為收組織樣本品質不一造成internal control band會粗細不 : 一所以才用這種方法掩蓋樣品收集的問題 : (例如有無灌流完全週邊的脂肪組織是否有去除等都會造成internal control在等量prot : ein跑WB band粗細卻不同 ) : 所以我建議原PO還是別用這種奇特的方法跑WB吧.... : paper多數都會寫loading多少量的total protein 所以都是有測蛋白質濃度後等量去跑 : 的吧... : 大家參考~ 最後我想講的是, 所有實驗的所有standardisation都一樣, 前提是你的target gene 必須是你當時細胞狀態/體積/數量/你想要看的什麼條件的忠實proxy, 像在跑E coli overexpression的時候我想大家應該也都用OD在做standardisation RNA/qPCR你也得確定你的actin或是GAPDH這個處理下沒有變化才拿來做delta delta T 如果這個條件不成立, 就算你用loading量做normalisation, 你的internal ctrl 變化量太大也一樣會被鞭. 一點想法供大家參考. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 131.111.5.162 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1488883398.A.623.html