PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

Re: [求救] WB internal control 定量問題

看板Biotech (生命科學)作者 (這就是人蔘呀~)時間7年前 (2017/03/07 17:47), 7年前編輯推噓1(1推 0噓 113→)
留言114則, 6人參與, 最新討論串5/6 (看更多)
跟老闆討論了一下這種方法是否可行 老闆說不行... 試著分享提到的幾個觀點 1.WB經過一抗二抗呈色出來的不是線性放大 所以此法不可行 (此外 我個人的經驗是 單單是曝光時間不同兩個band之間的倍數差異就會不同 可能1:2 變成1:1.8之類) 2.蛋白質濃度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸 這生化有教)來標準化sample internal control則是一種蛋白質 當然是前者比較能正確標準化sample (我表達的詞可能不是很正確但希望提出來大家想一想) 3.會出現這種方法可能是因為收組織樣本品質不一造成internal control band會粗細不 一 所以才用這種方法掩蓋樣品收集的問題 (例如有無灌流完全 週邊的脂肪組織是否有去除等都會造成internal control在等量prot ein跑WB band粗細卻不同 ) 所以我建議原PO還是別用這種奇特的方法跑WB吧.... paper多數都會寫loading多少量的total protein 所以都是有測蛋白質濃度後等量去跑 的吧... 大家參考~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.71.78.38 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1488880042.A.25E.html
→
03/07 18:10, , 1F
1.但是大家都是1:2變1:1.8 對相對定量來說不影響
03/07 18:10, 1F
→
03/07 18:19, , 2F
第1點不太同意,因為assay也會有倍數差異情況,關鍵在訊號飽
03/07 18:19, 2F
→
03/07 18:20, , 3F
合度;不要把paper那種又大又肥的band拿來比喻
03/07 18:20, 3F
→
03/07 18:20, , 4F
第2點,濃度是測特定AA而已,嚴格說也無法代表蛋白質含量阿
03/07 18:20, 4F
→
03/07 18:20, , 5F
第3點,雖然我看過以特定蛋白質來定量的paper不超過五篇,但
03/07 18:20, 5F
→
03/07 18:21, , 6F
但至少也真的有方法這麼做;而文字上也可以用reference
03/07 18:21, 6F
→
03/07 18:21, , 7F
蛋白的量來呈現target蛋白的量,說明清楚即可
03/07 18:21, 7F
→
03/07 18:22, , 8F
而類似的例子也有phospho/total protein的描述方式
03/07 18:22, 8F
→
03/07 18:24, , 9F
另外我不覺得paper特別偏好load ug數,如果是幹嘛秀control
03/07 18:24, 9F
→
03/07 18:44, , 10F
回完了才發現b大都講完了XD
03/07 18:44, 10F
→
03/07 19:33, , 11F
你寫的比較清楚完整阿
03/07 19:33, 11F
→
03/07 20:00, , 12F
請問b大說的"那幹嘛秀control"是指internal control的圖
03/07 20:00, 12F
→
03/07 20:00, , 13F
嗎?還是指control組?
03/07 20:00, 13F
→
03/07 20:07, , 14F
data不是要用除internal control後的ratio來計算 ?
03/07 20:07, 14F
→
03/07 20:10, , 15F
除下去就也是normalisation啊XD
03/07 20:10, 15F
→
03/07 21:12, , 16F
所以我以為要秀internal control圖的用意是因為ratio~ 如
03/07 21:12, 16F
→
03/07 21:13, , 17F
果說兩組別照原po方法第一次internal control 不同曝光後
03/07 21:13, 17F
→
03/07 21:13, , 18F
計算是1:2或1:1.8,那第二次跑膠是sample改成要loading量 2
03/07 21:13, 18F
→
03/07 21:13, , 19F
:1或1.8比:1 這樣對要看的蛋白的"組間"差異不會有影響嗎?
03/07 21:13, 19F
→
03/07 21:13, , 20F
如果這個蛋白組間差異小2:1或1.8:1 可能就看不出來到底
03/07 21:13, 20F
→
03/07 21:13, , 21F
有沒有差別了吧 所以我才會提出這個經驗來講 但不知想的
03/07 21:13, 21F
→
03/07 21:13, , 22F
對不對
03/07 21:13, 22F
→
03/07 21:30, , 23F
別管原po的方法了;在第1點,你(或老師)認為測濃度定量比較
03/07 21:30, 23F
→
03/07 21:30, , 24F
準確可行吧？ 那你們的paper是不是只需要寫放多少ug就好,
03/07 21:30, 24F
→
03/07 21:30, , 25F
不需要放actin,tubulin這些internal control了嗎？
03/07 21:30, 25F
→
03/07 21:31, , 26F
舉個例子
03/07 21:31, 26F
→
03/07 21:31, , 27F
有錯的話，麻煩幫忙修正一下謝謝
03/07 21:31, 27F
那為何要跑第二次?
→
03/07 21:37, , 28F
倒數第二行的B/IB應該改成Tb/Ib更有一致性
03/07 21:37, 28F
→
03/07 21:49, , 29F
謝謝b大指正，修改好囉!! http://imgur.com/Jis7xxa
03/07 21:49, 29F
→
03/07 21:52, , 30F
暈了= = 這次變打錯符號... http://imgur.com/qOnjGgA
03/07 21:52, 30F
→
03/07 22:04, , 31F
邊吃飯邊弄一直修錯QQ http://imgur.com/Sp4xvfG
03/07 22:04, 31F
我上面講的同次操作曝光造成的差異不是你舉例的情形
→
03/08 00:20, , 32F
回覆 blence 我們是覺得原po方法這樣反推不可行 不是覺
03/08 00:20, 32F
→
03/08 00:20, , 33F
得只要訂量蛋白就可以了 正規是用同樣ug下去跑WB 然後觀
03/08 00:20, 33F
→
03/08 00:20, , 34F
測的特定蛋白再除internal control得到ratio值 再去比較
03/08 00:20, 34F
→
03/08 00:21, , 35F
組間ratio值差異 paper一般看到也是說明多少ug 然後也會
03/08 00:21, 35F
→
03/08 00:21, , 36F
有hy internal control 所以應該是跟我們一樣做法 如果是
03/08 00:21, 36F
→
03/08 00:21, , 37F
用原po反推法的 根本就不會寫出是用多少ug 因為沒測protei
03/08 00:21, 37F
還有 39 則推文
還有 6 段內文
→
03/08 15:00, , 77F
而且,你也提到,當甲蛋白會受到實驗變化時會,改用乙蛋白
03/08 15:00, 77F
→
, , 78F
不就暗示對你而言,用ug總量就好,internal cont.完全不用跑
03/08 15:00
→
03/08 15:12, , 79F
依internal control去回推調整sample loading量
03/08 15:12, 79F
→
03/08 15:13, , 80F
就是你所說的normalization阿!! 只是前定量是計算出數值
03/08 15:13, 80F
→
03/08 15:14, , 81F
而後定試是反映到loading量去實際有動作的調整
03/08 15:14, 81F
→
03/08 15:15, , 82F
而在前定量出現甲不一致改用乙計算時
03/08 15:15, 82F
→
03/08 15:16, , 83F
後定量當然也是要跟著用乙阿!! routine的實驗中哪個
03/08 15:16, 83F
→
03/08 15:17, , 84F
control可用這是已知的是，前後定量不會有差異
03/08 15:17, 84F
→
03/08 15:18, , 85F
但在第一次做實驗時，一定會看複數個control才能知道
03/08 15:18, 85F
→ a90648: 哪個是可用的，這在前後定量都是一樣要做的事情 03/08 15:19 如果有空可以看一下我上面提的那篇 "Western Blot Normalizati on:Challenges and Considerations for Quantitative Analysis" 我大概就回覆到這裡了 ※ 編輯: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 15:58:39
→
03/08 23:52, , 86F
你舉的同次曝光時間不同造成的差異，當1:2變成1:1.8時
03/08 23:52, 86F
→
03/08 23:53, , 87F
代表已經過曝啦 請降低曝光時間
03/08 23:53, 87F
→
03/08 23:53, , 88F
至於我舉的例子為什麼要跑第二次，第一次的結果
03/08 23:53, 88F
→
03/08 23:54, , 89F
control粗細差了兩倍，雖然相對定量的結果不會變
03/08 23:54, 89F
→
03/08 23:54, , 90F
但是請問投paper時會放這種圖嗎?
03/08 23:54, 90F
→
03/09 00:04, , 91F
至於你提到的那篇的第4.2最後兩行就是再說後定法囉
03/09 00:04, 91F
→
03/09 00:05, , 92F
但就如前面大家提到的，internal control的選擇是很重要的
03/09 00:05, 92F
→
03/09 00:06, , 93F
當然裡面提到用Coomassie staining去看loading是否準確
03/09 00:06, 93F
→
03/09 00:06, , 94F
也是可以的
03/09 00:06, 94F
→
03/09 00:08, , 95F
雖然裡面是說去確認測的蛋白濃度是否準卻
03/09 00:08, 95F
→
03/09 00:09, , 96F
而後定法就是類似的作法只是少了一開始的測量濃度
03/09 00:09, 96F
→
03/09 00:12, , 97F
基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法
03/09 00:12, 97F
→
03/09 00:13, , 98F
得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題
03/09 00:13, 98F
→
03/09 00:13, , 99F
就讓大家自己做判斷了
03/09 00:13, 99F
→
03/11 21:52, , 100F
總算有心力來認真看一下&提一下我的疑問點
03/11 21:52, 100F
→
03/11 21:54, , 101F
WB的比較是在同一個基礎下去做比較的吧 前定量法loading時
03/11 21:54, 101F
→
03/11 21:55, , 102F
就是loading相同的蛋白量(不論定得準不準) 所以比較點是在
03/11 21:55, 102F
→
03/11 21:56, , 103F
相同蛋白量上去做比較 那看paper的人要怎麼知道你是真的同
03/11 21:56, 103F
→
03/11 21:57, , 104F
蛋白量呢? 所以我們會放所謂的internal control來顯示我是
03/11 21:57, 104F
→
03/11 21:59, , 105F
loading一樣的蛋白量 所以internal control只是用來證明我
03/11 21:59, 105F
→
03/11 22:00, , 106F
是loading一樣的證據
03/11 22:00, 106F
→
03/11 22:01, , 107F
那後定量法 在我的感覺上 變成我loading的是"相同tubulin
03/11 22:01, 107F
→
03/11 22:02, , 108F
量(or其他internal control) 這2者雖然看起來一樣但定義
03/11 22:02, 108F
→
03/11 22:03, , 109F
不太一樣吧??? 有點像白馬非馬
03/11 22:03, 109F
→
03/11 22:06, , 110F
雖然在實際操作時 我要看我定量定得準不準也是看壓出來的
03/11 22:06, 110F
→
03/11 22:08, , 111F
internal control.....= =||
03/11 22:08, 111F
→
03/12 02:20, , 112F
internal control的定義就是他可以反映loading的蛋白量阿
03/12 02:20, 112F
→
03/12 02:21, , 113F
在使用的internal control沒問題的情形
03/12 02:21, 113F
→
03/12 02:22, , 114F
定loading量和定internal control是一樣的事情
03/12 02:22, 114F
‣ 更多 tz2733 的文章
文章代碼(AID): #1Ole6g9U (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 tz2733 的文章
文章代碼(AID): #1Ole6g9U (Biotech)