Re: [問題] 請問PCR Full-length cDNA ?

看板Biotech (生命科學)作者werthers6925 (...)時間19年前 (2006/12/28 19:59)推噓4(4推 0噓 1→)

留言5則, 4人參與討論串2/9 (看更多)

※ 引述《mandible》之銘言： : PCR很多次了 : 還是P不出來 : 感覺primer dimer很明顯? : 請問高手有哪些方法?可以教導我!! : 我的條件是 : 94度C-1mins : 45度C-2mins : 72度C-3mins : 跑36 cycles : pcr product大概是784bp(我知道很短)但是就是跑不出來! : 用的是taq proofreading enzyme (因為要送去定序) : 大概是這樣!x 不知道你的primer設計多長? 不知道你有沒有查過PCR原理的書籍..... 這裡提供你一些建議: 設計primer時建議的長度是18~28mer左右 GC%最好在45~65% primer的3'端最好是C or G 因為會binding的比較緊..... primer設計的Tm值建議在60~65度C sense primer和anti-sense primer要注意會不會形成dimer或是自己形成hairpin... (這一項, 用軟體去模擬....我用的軟體是primer premier....) buffer中要有適量的Mg++....因為那是prolymerase活化所必需的東西.... dNTP不宜過量....因為過量的dNTP會搶走Mg++...反而使得polymerase活性降低.... 一般Taq ploymerase出錯率約為1/10000 有proofreading功能的出錯率約為1/100000~1/1000000 一般Taq ploymerase作用的速率約 1Kb/min 有proofreading功能的可能時間會長一點,估計1Kb/1.5min 有一些polymerase在做之前, 需要先進行HOT start (約95度C, 5~10min) (至於哪一些polymerase需要hot start, 要看你買哪一種enzymer決定.... 可以看catalog查詢) PCR condition:(一般情況) 95度C 30sec--->denature 55~65度C 30~60sec---> annealing 72度C time---->extension (這裡的時間, 取決於你的product size and polymerase種類) 言追正傳....回到你的問題首先, 我並不清楚你在設計primer時是否有check過sense and anti-sense primer是否會形成primer dimer 以及你primer的長度, CG%, Tm值...... 所以, 依你所給的資訊而盡量提供你有用的意見: 第一, 你可以提高annealing溫度,建議你先從55度開始試..... 如果可以的話...希望能能抓一下gradient Tm 從55度C抓到68度C..... 然後從中找一個溫度...是PCR product產率最好的也許你會問, 一開始annealing Tm到底要抓幾度才適合...... 一般來說, annealing Tm的抓法是根據你從廠商那裏得到的primer資訊他會建議你Tm是多少, 然後再從他給的Tm降低5~10度C... 作為annealing Tm開始往上抓..... 一般而言, annealing溫度不宜過低...... 溫度過低除了容易形成primer dimer....也會降低primer的專一性..... 你的annealing Tm真的是太低了....建議你往上提高...... 第二, 由於你是要從cDNA釣出所要的gene..... 有時primer的設計就一定要這麼設計...偏偏又容易形成primer dimer 這時怎麼辦? 有時, primer dimer的形成與sense, anti-sense primer兩者的比例有關.... 如果一直有primer dimer出現, 建議你可以試一下primer濃度condition 像以下這樣: 1倍 3/4倍 1/2倍 1/4倍 <---F primer的濃度 -------------------------------------------------------- 1倍 1 X 1 3/4 X 1 1/2 X 1 1/4 X 1 3/4倍 1 X 3/4 3/4 X 3/4 1/2 X 1 1/4 X 1 1/2倍 1 X 1/2 3/4 X 1/2 1/2 X 1/2 1/4 X 1/2 1/4倍 1 X 1/4 3/4 X 1/4 1/2 X 1/4 1/4 X 1/4 R-primer濃度共16組condition 不過這種condition的目的是為了減少primer dimer情形..... 由於你連target DNA都沒有做出來..... 所以不建議你這麼做.... 建議你先從annealing Tm值開始抓.... 希望你順利 Best -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.228.183