Re: [問題] 請問PCR Full-length cDNA ?

看板Biotech (生命科學)作者werthers6925 (...)時間19年前 (2006/12/29 14:49)推噓2(2推 0噓 0→)

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: 不知道你的primer設計多長? : 不知道你有沒有查過PCR原理的書籍..... : 這裡提供你一些建議: : 設計primer時建議的長度是18~28mer左右 : GC%最好在45~65% : primer的3'端最好是C or G 因為會binding的比較緊..... : primer設計的Tm值建議在60~65度C : sense primer和anti-sense primer要注意會不會形成dimer或是自己形成hairpin... : (這一項, 用軟體去模擬....我用的軟體是primer premier....) : buffer中要有適量的Mg++....因為那是prolymerase活化所必需的東西.... : dNTP不宜過量....因為過量的dNTP會搶走Mg++...反而使得polymerase活性降低.... : 一般Taq ploymerase出錯率約為1/10000 : 有proofreading功能的出錯率約為1/100000~1/1000000 : 一般Taq ploymerase作用的速率約 1Kb/min : 有proofreading功能的可能時間會長一點,估計1Kb/1.5min : 有一些polymerase在做之前, 需要先進行HOT start (約95度C, 5~10min) : (至於哪一些polymerase需要hot start, 要看你買哪一種enzymer決定.... : 可以看catalog查詢) : PCR condition:(一般情況) : 95度C 30sec--->denature : 55~65度C 30~60sec---> annealing : 72度C time---->extension (這裡的時間, 取決於你的product size : and polymerase種類) : 言追正傳....回到你的問題 : 首先, 我並不清楚你在設計primer時 : 是否有check過sense and anti-sense primer是否會形成primer dimer : 以及你primer的長度, CG%, Tm值...... : 所以, 依你所給的資訊而盡量提供你有用的意見: : 第一, 你可以提高annealing溫度,建議你先從55度開始試..... : 如果可以的話...希望能能抓一下gradient Tm : 從55度C抓到68度C..... : 然後從中找一個溫度...是PCR product產率最好的 : 也許你會問, 一開始annealing Tm到底要抓幾度才適合...... : 一般來說, annealing Tm的抓法是根據你從廠商那裏得到的primer資訊 : 他會建議你Tm是多少, 然後再從他給的Tm降低5~10度C... : 作為annealing Tm開始往上抓..... : 一般而言, annealing溫度不宜過低...... : 溫度過低除了容易形成primer dimer....也會降低primer的專一性..... : 你的annealing Tm真的是太低了....建議你往上提高...... : 第二, 由於你是要從cDNA釣出所要的gene..... : 有時primer的設計就一定要這麼設計...偏偏又容易形成primer dimer : 這時怎麼辦? : 有時, primer dimer的形成與sense, anti-sense primer兩者的比例有關.... : 如果一直有primer dimer出現, 建議你可以試一下primer濃度condition : 像以下這樣: : 1倍 3/4倍 1/2倍 1/4倍 <---F primer的濃度 : -------------------------------------------------------- : 1倍 1 X 1 3/4 X 1 1/2 X 1 1/4 X 1 : 3/4倍 1 X 3/4 3/4 X 3/4 1/2 X 1 1/4 X 1 : 1/2倍 1 X 1/2 3/4 X 1/2 1/2 X 1/2 1/4 X 1/2 : 1/4倍 1 X 1/4 3/4 X 1/4 1/2 X 1/4 1/4 X 1/4 : R-primer濃度 : 共16組condition : 不過這種condition的目的是為了減少primer dimer情形..... : 由於你連target DNA都沒有做出來..... : 所以不建議你這麼做.... : 建議你先從annealing Tm值開始抓.... : 希望你順利 : Best 不好意思, 再補充一點...是關於PCR做不出來的可能性........ 你應該是從某一個tissue抽取他的mRNA...然後轉成cDNA...... 接著設計你所想要釣出的target DNA primer.... 然後去做定序......... 我之前的發言好像有一點轉移了焦點....focus on primer dimer的形成..... 很抱歉, 沒有回答你真正想要的答案...... 你的問題應該是為什麼做不出來...... 在此先向您說聲抱歉...... PCR做不出來可能的情況: 第一, 完全沒有任何band: 請先check 你當初抽取mRNA的tissue.... 是否真的有表達出你的target gene..... 如果是不會表現....那做在多次都不會作出來..... 為了釐清做不出來是因為primer的問題, 還是cDNA的問題... 建議你在做的時候加一組positive control...... 確定primer是可以work的............ 第二, 有做出band, 但是major band很弱...或是有很多雜band: 建議你上NCBI輸入你的primer seq.去做blast.... check一下你的primer是不是很容易binding到其他gene上.... 如果primer的專一性不夠好....建議你重新設計primer.... 希望你順利..... Best -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.54.2