[求救] site-directed mutagenesis

看板Biotech (生命科學)作者 (keep in touch)時間14年前 (2011/04/29 20:42), 編輯推噓9(9026)
留言35則, 8人參與, 最新討論串1/9 (看更多)
各位前輩大家好, 最近實驗室在進行將wild-type細胞改造成mutation type的細胞株 由於實驗室除了教授外,目前只有我一人> <,所以來這邊詢問各位。 查了很多資料,但都沒有這方面的資訊。 可能我用的key word不夠準確。(ex establish mutation cell)。 所以來這邊請教各位。 我已經有初步的想法 先將wild type cell cDNA clone到pCDNA3.3 TOPO的vector內, 再利用quikchange kit進行基因突變 最後轉染到wildtype的細胞內。 我想請問各位的是 當我設計cDNA primer時,是否要增幅full-lengh或者只需要設計 將要進行突變的exon部分?? 謝謝大家!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.160.148.226

04/29 21:58, , 1F
CDS即可。
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04/29 23:20, , 2F
樓上的前輩非常感謝您。我還有個問題想請教(因為實在是新手)
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04/29 23:22, , 3F
所謂CDS的意思是說從CDS到stop codon嗎?
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04/29 23:29, , 4F
謝謝學長(姊)幫忙~~
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此外,我想問前輩如果要進行上述的實驗,我可以clone DNA
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還是必須使用cDNA? (所謂DNA是RT-PCR後的DNA??_)
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三樓,CDS最後不是stop codon嗎?
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五六樓的意思不太懂 總之就是RT-PCR後,設計CDS的primer
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把CDS夾出來之後,切一切接到vector裡面
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喔~~~樓上的學長(姊)我懂了..就是可以接RT-PCR後的產物!!
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你的cDNA primer就是夾coding的地方吧 你所謂的exon
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P出來clone到plasmid上再用mutagenesis的primer
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此primer的設計請參考protocol 就這麼簡單
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所以RT之後PCR及mutation共用到兩組不同的primer
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RT-PCR之後是cDNA,cDNA中的CDS才是你要接進去的...
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教授不是做分生的嗎? 這樣的問題應該可以問教授吧?
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改一下,RT-PCR之後是cDNA,cDNA中的CDS才是你要接進去的
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沒改到..RT-PCR產物是cDNA,cDNA中的CDS才是你要接進去的
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sorry~~教授不是分生的~~他是電機的~~~
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我因為也不是本科系的~~所以 才來這邊求助大家!謝謝~~
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04/30 09:29, , 21F
因為我一直以為作完RT的產物是cDNA,PCR後才是DNA。
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04/30 10:43, , 22F
電機系? 跨真大 @@
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04/30 10:54, , 23F
嗯...其實我覺得你好像還沒完全瞭解的樣子...
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04/30 10:55, , 24F
我沒實際操作過RT-PCR,這方面的步驟還請熟悉的版友解答
04/30 10:55, 24F

04/30 14:30, , 25F
文章看不出來是要做mutant transgene(將壞的基因送到細胞)
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還是gene targeting(將細胞內原有正常基因置換成mutant)
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說的對...gene targeting完全是另一種做法...
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如果完成實驗的目標還是親自找校內其它實驗室合作,免得兩個
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分生不了解的,就算有成功還不見得是你們認為的
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04/30 14:38, , 30F
不是想低估非本科系的就做不出來,而是前面po文就知道不簡單
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或是用RNAi打掉內生性蛋白,在同時表達RNAi resistant
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04/30 15:36, , 32F
的mutant protein.
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04/30 22:43, , 33F
cDNA跟PCR product都是dsDNA :)
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04/30 22:44, , 34F
原PO可能要把central dogma稍微看一遍有個概念
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04/30 22:45, , 35F
不然就算知道要去查molecular cloning也不一定看懂
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文章代碼(AID): #1Dkh9DIe (Biotech)
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