Re: [求救] site-directed mutagenesis

看板Biotech (生命科學)作者tutj (人生若只初相見)時間13年前 (2011/11/12 14:45)推噓3(3推 0噓 4→)

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※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : 我現在是做A基因的點突變， : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 complement primer應該是stratagene QuikChange的方法吧？ : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : 心想應該行不通 : F1----------> F2---------> : ------------------------------------------------------ : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : R1<--------- : R2<---------- : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。你的Tm值是照說明書的公式算的嗎？我有找到一個網站可以幫忙算 http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html 如果你是照公式算, 說明書要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低這方法Tm值一定要夠高。因為primer完全complement, 還有突變的base 所以primer間的Tm值會比primer對DNA template的Tm值高如果一開始設計的Tm不夠高 PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper 裡面說QuikChange有幾個缺點。一是上面提的易形成primer dimer 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick 一對primer又是完全complement 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template 那篇paper發明了一種新方法 F1 ---------m-----------> ------------------*----------------------------------- *: nick |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation -----------------------------------*------------------ R1<-----------------m------ 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率 paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供根據我整理的protocol 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃ PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair, 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM) 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul PCR program: 1. 95℃ 5 min x1 cycle 2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles) Tm no-5℃ 1 min 72℃ 1 kp/2 min 3. 95℃ 1 min x1 cycle Tm pp-5℃ 1 min 72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率) elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃ 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃ 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band 提供給你參考~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 175.181.106.80