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Re: [求救] site-directed mutagenesis

看板Biotech (生命科學)作者 (台南工作的基隆人)時間13年前 (2011/11/16 18:11), 編輯推噓0(0推 0噓 2→)
留言2則, 1人參與, 最新討論串6/9 (看更多)
※ 引述《aggaci (台南工作的基隆人)》之銘言： ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : 我現在是做A基因的點突變， : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : 心想應該行不通 : F1----------> F2---------> : ------------------------------------------------------ : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : R1<--------- : R2<---------- : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。 我的方法不一樣 提供給大家 我的是 P---------m-----------> ------------------------------------------------------ m:mutation |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------ <---------------P 這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做 要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate 因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation...... 效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多 另外我用的是fynzyme的phusion pfu 這pfu超好用 作的 超準 超快 超多 -- 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.121 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
推
11/16 00:35,
推phusion 超貴超好用
11/16 00:35
→
11/16 01:01,
這方法聽起來不錯！ 照你這樣講的話，primer不事先加P應
11/16 01:01
→
11/16 01:01,
該也是可以的，只是之後要多一道PNK的步驟
11/16 01:01
→
11/16 01:11,
對阿 要多磷酸化這一步
11/16 01:11
推
11/16 01:34,
有重疊的好處是不用ligation,pcr完就可以transform了
11/16 01:34
→
11/16 01:35,
不重疊的話 就是blunt end ligation囉
11/16 01:35
推
11/16 10:14,
phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多
11/16 10:14
推
11/16 11:30,
blunt end self ligation超好作的，不可能會失敗...
11/16 11:30
→
11/16 11:52,
真的 但不管怎樣 肯定比TWO-STEP pcr好做很多
11/16 11:52
推
11/16 15:01,
想請問樓上們，把 plasmid 做一圈出來的方法，
11/16 15:01
→
11/16 15:01,
要怎麼確定沒有不小心錯在 plasmid 上?
11/16 15:01
→
11/16 15:02,
我們實驗室都很怕死的做 2 step PCR
11/16 15:02
→
11/16 15:02,
雖然速度沒有慢很多，但是還是很多步驟。
11/16 15:02
簡單阿 我們lab的做法是 insert 沒錯就好 之後把insert 切下來再接到新的vector上 2 step pcr難用又難做
→
11/16 15:03,
請大家給點建議~~~ 謝謝^^
11/16 15:03
推
11/16 17:30,
用pfu
11/16 17:30
PFU還是無法保証vector sequence有沒出錯 除非你去對整個vector定序 所以最安全的做法是 把insert 切下來再接到新的vector上 -- 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.121 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/16 18:12)
→
11/16 19:12, , 1F
我的作法是PCR產物處理DpnI後 產物+PNK+Ligase 在16度2h
11/16 19:12, 1F
→
11/16 19:13, , 2F
效果也不錯!
11/16 19:13, 2F
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