[求救] site-directed mutagenesis
我現在是做A基因的點突變，
用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
心想應該行不通
F1----------> F2--------->
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
R1<---------
R2<----------
二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.202.163
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11/11 20:50, , 4F
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anchi35大，你是說把primer設計到vector中，離A基因的3'end有一段距離也可以囉？
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11/11 20:51, , 5F
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blence大，你說的我做過，不過沒成功QQ 還是要多做幾次transform看能不能賽到一次XD
※ 編輯: nhxcyge 來自: 140.114.202.163 (11/11 21:24)
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11/11 22:55, , 7F
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