Re: [求救] site-directed mutagenesis
※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: 我現在是做A基因的點突變，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
: 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: 心想應該行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
我的方法不一樣 提供給大家
我的是
P---------m----------->
------------------------------------------------------ m:mutation
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<---------------P
這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做
要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate
因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation......
效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多
另外我用的是fynzyme的phusion pfu
這pfu超好用 作的 超準 超快 超多
--
單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
推
11/16 00:35, , 1F
11/16 00:35, 1F
→
11/16 01:01, , 2F
11/16 01:01, 2F
→
11/16 01:01, , 3F
11/16 01:01, 3F
→
11/16 01:11, , 4F
11/16 01:11, 4F
推
11/16 01:34, , 5F
11/16 01:34, 5F
→
11/16 01:35, , 6F
11/16 01:35, 6F
推
11/16 10:14, , 7F
11/16 10:14, 7F
推
11/16 11:30, , 8F
11/16 11:30, 8F
→
11/16 11:52, , 9F
11/16 11:52, 9F
推
11/16 15:01, , 10F
11/16 15:01, 10F
→
11/16 15:01, , 11F
11/16 15:01, 11F
→
11/16 15:02, , 12F
11/16 15:02, 12F
→
11/16 15:02, , 13F
11/16 15:02, 13F
→
11/16 15:03, , 14F
11/16 15:03, 14F
推
11/16 17:30, , 15F
11/16 17:30, 15F
推
11/17 11:38, , 16F
11/17 11:38, 16F
→
11/17 11:39, , 17F
11/17 11:39, 17F
→
11/17 11:41, , 18F
11/17 11:41, 18F
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 5 之 9 篇)：
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章